Gsm和2—Mib在斑馬魚體內的富集及暫養效果研究

摘要：利用固相微萃取-氣質聯用和內標定量技術建立了水體和斑馬魚體內土臭素（Gsm）和二甲基異冰片（2-Mib）的分析方法，并利用該方法研究水體中Gsm和2-Mib在斑馬魚體內的富集和暫養效果。結果表明，水體中不同濃度Gsm和2-Mib的添加回收率范圍為97.2%～109.9%和88.5%～101.6%，斑馬魚中不同濃度Gsm和2-Mib的添加回收率范圍為78.5%～87.2%和88.3%～91.4%；水體中不同濃度的Gsm和2-Mib能在魚體內較快富集，魚體內Gsm和2-Mib濃度和水體中的濃度成正相關；魚體內Gsm和2-Mib的濃度和暫養時間成反相關，但降低較慢。水體中的Gsm和2-Mib通過魚鰓和體表迅速富集到魚體中，成為魚體土腥味來源的主要外源因子，清水暫養對土腥味物質Gsm和2-Mib的去除有一定作用，但仍需配合其他去除方法使用效果更佳。

關鍵詞：土臭素；2-甲基異冰片；固相微萃取；氣質聯用；暫養

中圖分類號：X174 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）16-4272-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.16.051

魚類相比陸生動物能為人們提供更加營養安全的動物蛋白，但由于捕獲前特有的異味物質直接影響魚類產品的品質，使得產品價值大打折扣，對水產業發展帶來很大的負面影響[1]。魚類捕獲前異味化合物主要來源于水體和餌料，目前為止已報道導致魚體產生土腥味的最常見的兩種物質為Gsm和2-Mib[2～6]，來源于水生微生物（如藍藻）的次生代謝產物，都具有雙環叔醇結構。盡管Gsm和2-Mib在環境中的濃度很低，但由于其極低的異味閾值，因此仍是魚體異味產生的主要貢獻化合物[7，8]。本試驗結合固相微萃取和氣質聯用的方法建立水體和斑馬魚體中Gsm和2-Mib的內標法定量分析方法，并利用該方法結合斑馬魚暴露和暫養試驗分析Gsm和2-Mib在魚體內的富集和暫養去除效果，為捕獲前魚體內土腥味物質的形成機制及控制措施提供方法與數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用斑馬魚購自中國科學院水生生物研究所，Gsm和2-Mib標品、1-氯癸烷、飽和食鹽水等其他試劑均為分析純。

7890A-5975C氣質聯用儀，DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器，CAR/DVB固相微萃取萃取頭和手柄。

1.2 方法

1.2.1 氣質聯用儀條件 參照文獻[9-12]，色譜柱：DB-5MS彈性毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升溫：柱初溫30 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至60 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min升溫至250 ℃，保持2 min，最后以20 ℃/min升溫至280 ℃，保持2 min；進樣口溫度250 ℃；載氣流量1 mL/min；不分流；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度 150 ℃；電子能量 70 eV；離子質量掃描范圍（m/z）45～350，設定Gsm和2-Mib的SIM定量離子。

1.2.2 標準曲線的繪制 分別取10 mL ddH2O和 3 g斑馬魚肉加入7 mL飽和食鹽水溶液的混合勻漿液，再分別加入5 ng 1-氯癸烷內標和混標（Gsm和2-Mib）0.2、0.5、1、2、5、10和20 ng，將裝配好的CAR/DVB萃取頭插入頂空瓶中。在集熱式恒溫磁力攪拌器中60 ℃恒溫萃取50 min，取出萃取頭插入氣相進樣口，熱解析5 min。標準曲線橫坐標為Gsm和2-Mib與內標的濃度比，縱坐標為Gsm和2-Mib與內標的峰面積比。

1.2.3 添加回收率 分別取10 mL ddH2O和3 g 斑馬魚肉加入7 mL飽和食鹽水溶液的混合勻漿液，再分別加入5 ng 1-氯癸烷內標和混標（Gsm和2-Mib），使水溶液中Gsm和2-Mib的終濃度分別為0.1、0.3、0.5、1.0 μg/L（每個添加濃度3個平行），將裝配好的CAR/DVB萃取頭插入頂空瓶中。在集熱式恒溫磁力攪拌器中60 ℃恒溫萃取50 min，取出萃取頭插入氣相進樣口，熱解析5 min。根據標準曲線計算濃度與實際添加濃度的比值，計算添加回收率。

1.2.4 斑馬魚暴露富集試驗 將4月齡斑馬魚養殖在混標濃度分別為1 μg/L和0.1 μg/L的水樣中，暴露0、2、7 d后分別采集水樣和魚樣，利用建立的固相微萃取-氣質聯用的方法測定樣品中Gsm和2-Mib的濃度。

1.2.5 斑馬魚暫養試驗 將暴露7 d的斑馬魚暫養在不含Gsm和2-Mib的清水中，養殖0、2、7 d分別采集水樣和魚樣，利用建立的固相微萃取-氣質聯用的方法測定樣品中Gsm和2-Mib的濃度。

2 結果與分析

2.1 方法的線性范圍、檢測限和添加回收率

利用混標配制范圍為0.02～2.0 μg/L的系列濃度梯度，經固相微萃取富集處理后進氣質分析，以信噪比S/N=3所對映的被測化合物濃度作為方法的檢出限（LOD）（表1）。

添加回收率試驗以Gsm和2-Mib的標準曲線為計算基礎，每個添加濃度設置5個平行，水樣中混標的添加終濃度分別為0.1、0.3、0.5和1.0 μg/L，斑馬魚體中混標的添加終濃度分別為0.3、0.5和1.0 μg/L。

從表2可看出，水樣中不同濃度Gsm和2-Mib的添加回收率分別為97.2%～109.9%和88.5%～101.6%，并且5個平行添加濃度間的相對標準偏差均小于10%，表明建立的固相微萃取-氣質聯用方法重現性好，可用于實際水體樣品中Gsm和2-Mib的定量檢測分析。

從表3可以看出，斑馬魚樣中不同濃度Gsm和2-Mib的添加回收率分別為78.5%～87.2%和88.3%～91.4%，比水樣中的回收率要低，可能跟魚樣中含脂量高相關。魚樣中5個平行添加濃度間的相對標準偏差均小于10%，表明建立的固相微萃取-氣質聯用方法重現性好，可用于實際斑馬魚樣品中Gsm和2-Mib的定量檢測分析。

2.2 Gsm和2-Mib在斑馬魚體內的富集

本試驗分析了暫養過程中（0、2和7 d）水體和斑馬魚體內Gsm和2-Mib的濃度變化情況。從圖1和圖2可以看出，水樣中Gsm和2-Mib的濃度隨暫養時間延長而逐漸降低，2 d內水樣中Gsm和2-Mib的濃度明顯下降，低濃度時水樣中Gsm下降速率較2-Mib要快。

從圖3和圖4可以看出，斑馬魚暴露在不同濃度Gsm和2-Mib的水體中，2 d內Gsm和2-Mib會迅速富集到斑馬魚體內，并且Gsm的富集速率明顯比2-Mib要快。

2.3 Gsm和2-Mib的清水暫養結果

研究了暫養對斑馬魚體內Gsm和2-Mib的去除效果，分析了暫養過程中（0、2和7 d）斑馬魚體內Gsm和2-Mib的濃度變化情況。從圖5和圖6可以看出，不同濃度Gsm和2-Mib暴露7 d的斑馬魚經清水暫養后，斑馬魚體內Gsm和2-Mib的濃度隨暫養時間延長而逐漸降低，但去除較緩慢。

3 小結與討論

Gsm和2-Mib兩種土腥味物質已有大量研究報道，但主要是有關水體異味化合物的研究[13，14]，特別是飲用水中的含量測定和脫除方法研究，近年來已有研究人員開展魚體內Gsm和2-Mib測定方法的研究報道，如王國超等[15]利用微波蒸餾-固相微萃取-氣相色譜-質譜方法建立了羅非魚體中Gsm和2-Mib的定量分析方法，薛勇等[16]利用微波蒸餾提取-固相微萃取富集-氣質聯用的方法建立了鳙魚體內Gsm和2-Mib的定量測定方法。但利用模型魚類研究魚體內Gsm和2-Mib的富集和清水暫養的研究鮮有報道。

本試驗利用固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術建立了水體和斑馬魚體中Gsm和2-Mib的內標定量分析方法。水樣中不同濃度Gsm和2-Mib的添加回收率分別為97.2%～109.9%和88.5%～101.6%，并且5個平行添加濃度間的相對標準偏差均小于10%，檢測限均為5 ng/L；斑馬魚樣中不同濃度Gsm和2-Mib的添加回收率分別為78.5%～87.2%和88.3%～91.4%，魚樣中5個平行添加濃度間的相對標準偏差均小于10%，檢測限分別為21.2 ng/L和11.5 ng/L；說明所建立的定量分析方法可用于實際水體和斑馬魚樣品中Gsm和2-Mib的定量檢測分析。魚體中不同濃度Gsm和2-Mib的添加回收率都比水樣中要低，可能跟魚樣中含脂量高從而影響Gsm和2-Mib在萃取頭上的富集有關。

利用建立的方法通過暴露和清水暫養試驗研究了不同濃度Gsm和2-Mib在魚體內的富集和暫養去除效果，斑馬魚暴露在不同濃度Gsm和2-Mib的水體中，2 d內水體中Gsm和2-Mib的濃度迅速降低，斑馬魚體內的Gsm和2-Mib濃度迅速升高；然后隨暴露時間的延長，水體中Gsm和2-Mib的濃度逐漸降低，斑馬魚體內Gsm和2-Mib的濃度逐漸升高，并且Gsm的富集速率明顯比2-Mib要快，魚體內異味化合物的濃度和暴露初始濃度成正相關。從而說明環境水體中的Gsm和2-Mib是魚體產生土腥味的主要外源化合物，通過鰓和魚體表進入魚體富集。Gsm的富集速率和富集倍數明顯比2-Mib大，這也可能是文獻報道魚體中常能檢測到Gsm，而檢測不到2-Mib的客觀原因。

清水暫養試驗結果表明，隨暫養時間的延長，斑馬魚體內的Gsm和2-Mib的濃度也逐漸降低，但去除效果不明顯，說明魚體中脂溶性的Gsm和2-Mib很難僅通過清水暫養來達到好的去除效果，需結合其他去除方法方能為人們提供優質安全可接受的動物蛋白源。

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