響應面法對香椿葉總黃酮提取工藝的優化

摘要：為了提高香椿（Toona Sinensis）葉總黃酮的純化效率，試驗以鄂東地區野生香椿為材料，采用響應面法建立了H-107大孔樹脂對香椿葉中黃酮動態吸附和解吸的二次多項數學模型，并驗證了模型的有效性。結果表明，H-107大孔樹脂對香椿葉總黃酮動態吸附參數為上樣液濃度1.60 mg/mL、上樣液流速0.5 mL/min、上樣液pH 5.0。H-107大孔樹脂的最優動態吸附率驗證值為98.7%（理論值為99.1%）；H-107大孔樹脂對香椿葉中黃酮動態解吸率的工藝參數為解吸液體積分數64.88%、解吸液流速0.91 mL/min、解吸液體積99.11 mL、H-107大孔樹脂的最優動態解吸率驗證值為87.21%（理論值為88.45%）。上述結果表明，H-107大孔樹脂對香椿葉中總黃酮有較好的吸附解吸性能。

關鍵詞：香椿（Toona Sinensis）；總黃酮；響應面法；吸附；解吸

中圖分類號：S644.4；R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）16-4253-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.16.046

香椿（Toona sinensis）又名香椿芽、香樁頭、椿天等，屬楝科，原產于中國，廣泛分布于長江南北平源地區和大別山區[1，2]。香椿中黃酮類物質含量較高，黃酮類化合物具有心血管系統活性、抗腫瘤、抗氧化自由基、抗炎等多種生物活性[3，4]。目前已有多種方法從香椿葉中提取并純化黃酮類化合物，這些方法包括堿浸酸沉法[5]、酶解法[6]、超臨界CO2流體萃取法[7]、薄層析法[8]等。大孔樹脂是一類有機高分子聚合物吸附劑，具有吸附量大、選擇性好、可重復使用等優點，已廣泛用于生物活性物質的分離純化[9]。目前采用響應面法優化大孔樹脂純化香椿葉中總黃酮的研究報道較少。本研究以H-107大孔樹脂為吸附載體，采用響應面法優化香椿葉總黃酮的提取純化工藝，為進一步開發利用香椿葉總黃酮資源提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

香椿葉采自湖北省麻城市木子店鎮，于2014年6月上旬采集。

蘆丁（純度為99.9%）購自四川光泰制藥有限公司；H-107樹脂（非極性）購自鄭州亨通化工；NaCl、NaOH、NaNO2、Al（NO3）3、石油醚、環己烷、無水乙醇均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 樹脂預處理 將H-107樹脂完全浸入乙醇中，并不斷攪拌，以除去氣泡，靜置24 h后將樹脂裝入1.5 cm×50.0 cm玻璃層析柱中，用2倍體積的乙醇以3.0 mL/min的流速沖洗樹脂，至洗脫液無白色渾濁物，再用蒸餾水以同樣流速沖洗樹脂至無醇，完全洗脫后，先酸洗再堿洗，即先用2倍體積1.0 mol/L的鹽酸浸泡，同時沖洗樹脂，流速為6.0 mL/min，再以同樣流速的蒸餾水沖洗至中性，然后以2倍體積的1.0 mol/L的氫氧化鈉溶液沖洗樹脂，最后按同樣的流速用蒸餾水沖洗至中性備用。

1.2.2 香椿葉總黃酮的粗提 稱取新鮮采集的香椿葉500 g于55 ℃恒溫箱中干燥至恒重，粉碎，過40目篩后用濾紙將香椿葉包好放入索氏抽提器中，在圓底燒瓶中加入300 mL石油醚，70 ℃脫脂6 h后，再將香椿葉烘干至恒重。稱取上述香椿葉5.0 g研磨成粉末樣品，以70%乙醇水溶液，于200 W功率下超聲處理30 min后，于70 ℃抽提兩次，每次1.5 h，料液比為1∶20（g∶mL，下同），合并兩次提取液。采用乙醇沉淀法除去蛋白質、多糖等雜質[10]，減壓回收乙醇，將濃縮液轉入水相用環己烷除去葉綠素，得到總黃酮粗提取液。

1.2.3 H-107大孔樹脂動態吸附與解吸 準確稱取經預處理后的H-107樹脂10.0 g，瀝干水分，濕法裝入1.5 cm×50.0 cm玻璃層析柱中。將10.0 mL總黃酮粗提液緩慢倒入層析柱，進行動態吸附直至樣品全部流出為止。再用20.0 mL超純水洗去可溶性多糖及雜質，最后用一定體積分數的乙醇溶液進行洗脫[11]。按下述公式分別計算動態吸附率和解吸率：

吸附率=（C0-CV）/C0×100%；

解吸率=C3V2/[（C0-C1）V0-C2V1]×100%

式中，CV為吸附后溶液中總黃酮濃度；C0為吸附前溶液中總黃酮質量濃度，mg/mL；C1為吸附后溶液中總黃酮質量濃度，mg/mL；C2為除雜用水中總黃酮質量濃度，mg/mL；C3為解吸液中黃酮質量濃度，mg/mL；V0為供試總黃酮提取液體積，mL；V1為除雜用水體積，mL；V2為解吸液體積，mL。

1.2.4 動態吸附和動態解吸條件 在前期單因素試驗基礎上，將上樣液速率、濃度、pH作為影響動態吸附率的3個主要因素，每個因素設3個水平，試驗因素與水平見表1；將洗脫液流速、體積、體積分數作為影響動態解吸率的3個主要因素，每個因素設3個水平，試驗因素與水平見表2。借助DX8Trial軟件中響應面曲面法Box-Behnken設計，各產生17組試驗，所得試驗數據均采用DX8Trial軟件內部程序進行回歸分析和方差分析。

1.2.5 總黃酮濃度的測定

1）標準曲線的測定。以蘆丁為標準品，采用NaNO2-Al（NO3）3比色法[12]。稱取干燥至恒重的蘆丁標準品0.01 g，于60 ℃水浴中溶于70%乙醇，并定容至100 mL，配制成濃度為0.1 mg/mL蘆丁標準溶液。分別取上述標準液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于6支試管中，加入0.3 mL 5% NaNO3溶液搖勻，靜置6 min后再加入適量10% Al（NO3）3溶液搖勻，靜置6 min后加入4% NaOH溶液搖勻，最后加70%乙醇定容至10.0 mL，靜置15 min后采用分光光度法測510 nm處吸光度。以吸光度Y對蘆丁濃度X繪制標準曲線（圖1），回歸方程為Y=10.581 3X+0.002 47（R2=0.999 7），其中X為蘆丁濃度（mg/mL），Y為吸光度。

2）提取液中總黃酮濃度的測定。取香椿葉總黃酮提取液1.0 mL，按上述方法測定510 nm處吸光度，根據標準曲線求出提取液中總黃酮的濃度。

2 結果與分析

2.1 香椿葉總黃酮的粗提

試驗采用單一溶劑提取，粗提液中總黃酮濃度為1.21 mg/mL，總黃酮提取率為4.7%，后采用超聲波輔助提取，粗提液中總黃酮濃度為1.47 mg/mL，提取率為5.7%（圖2）。采用超聲波輔助提取的提取率較單一溶劑的提取率提高約21.28%。

2.2 動態吸附的響應面試驗結果

根據DX8Trial軟件中的Box-Behnken中心組合試驗設計原理，選取影響H-107大孔樹脂動態吸附總黃酮的主要因素（上樣液濃度、上樣液流速、上樣液pH）進行3因素3水平試驗，利用響應面分析法優化香椿葉中總黃酮純化工藝參數。根據表3數據建立二次回歸方程。回歸方程為：吸附率=44.49+17.82A+26.12B+10.93C+1.16AB-1.13AC-5.55BC-3.97A2-5.82B2-0.32C2。模型顯著檢驗P<0.05，表明該模型具有統計學意義，由表4中方差分析可知，自變量一次項A、B、C和二次項AB、AC、BC、A2、B2顯著性檢驗值P<0.05。失擬項P=0.859 1>0.05，無失擬因素存在，表明該模型真實可行。

圖3直觀的反應了各因素交互作用對動態吸附率的影響，曲線越陡峭，等高線越密集，表明該因素的變化對動態吸附率的影響越大。從圖3a可以看出，與上樣液濃度曲面相比，上樣液流速曲面比較陡峭，說明上樣液流速對動態吸附率的影響較大。從圖3b可以看出，上樣液濃度曲面陡峭，而上樣液pH曲面比較平緩，說明與上樣液pH相比，上樣液濃度對動態吸附率的影響較大。從圖3c可以看出，上樣液流速方向等高線比較密集，說明上樣液流速對動態吸附率的影響比上樣液pH大。通過軟件分析確定的樹脂最優動態吸附條件為：上樣液濃度1.60 mg/mL，上樣液流速0.5 mL/min，上樣液pH 5.0，H-107大孔樹脂的最優動態吸附率為98.7%（理論值為99.11%）。

2.3 動態解吸的響應面試驗結果

根據DX8Trial軟件中的Box-Behnken中心組合試驗設計原理，選取影響H-107大孔樹脂動態解吸的主要因素（解吸液體積分數、解吸液體積、解吸液流速）進行3因素3水平中心組合試驗，利用響應面分析法優化香椿葉中總黃酮純化工藝參數。根據表5數據建立二次回歸方程?；貧w方程為：解吸率=-161.95+4.53E+32.36F+1.79D-0.01EF-0.004DE-0.09DF-0.03E2-12.22F2-0.007D2

從表5中可知，當洗脫液體積為100 mL、洗脫液體積分數為70%、洗脫液流速為1.0 mL/min時，H-107大孔樹脂對黃酮的解吸率達到最大88.06%，當洗脫條件相同時，解吸率相差不明顯，說明試驗操作引起的誤差較小。模型顯著檢驗P<0.05，表明該模型具有統計學意義，由表6中方差分析可知，自變量一次項D、E、F和二次項DE、DF、D2、E2、F2顯著P<0.05。失擬項P值為0.316 3>0.05，無失擬因素存在，表明該模型真實可行。由P值可以看出影響H-107大孔樹脂動態解吸率的因素為：體積分數>流速>體積。

圖4綜合反映了各因素的交互作用對動態解吸率的影響。從圖4a可以看出，解吸液體積分數方向上響應曲面比較陡峭且等高線密集，說明與解吸液流速相比解吸液體積分數對H-107樹脂動態解吸的影響較大。從圖4b可以看出，與解吸液體積相比解吸液體積分數方向上的曲面圖更加陡峭且等高線密集，說明解吸液體積分數對H-107樹脂動態解吸的影響較大。從圖4c可以看出，與解吸液體積相比解吸液流速方向上曲面更加陡峭且等高線密集，說明解吸液流速對H-107樹脂動態解吸的影響較大。

由回歸方程確定的最優動態解吸率條件為：解吸液體積分數64.88%，解吸液流速0.91 mL/min，解吸液體積99.11 mL，H-107樹脂的最優動態解吸率為87.21%（理論值為88.45%）。

3 小結與討論

本試驗采用響應面法優化了香椿葉總黃酮提取純化工藝，克服了單因素及正交設計只能處理離散的水平值，而無法找出整個區域上各影響因素最佳組合和找出最優響應值的缺陷[13]，從而為香椿葉中總黃酮的提取純化提供了更加有效的辦法，減少了試驗誤差，提高了純化效率。

試驗采用響應曲面法建立H-107大孔樹脂吸附香椿葉總黃酮的動態吸附和動態解吸的二次多項數學模型，并通過利用DX8Trial軟件進行分析，同時利用模型的響應面對影響香椿葉中總黃酮吸附特性的關鍵因素及相互作用進行探討，得到H-107大孔樹脂對香椿葉中總黃酮動態吸附的工藝參數為：上樣液濃度1.60 mg/mL，上樣液流速0.5 mL/min，上樣液pH 5.0，H-107大孔樹脂的最優動態吸附率驗證值為98.7%（理論值為99.11%）；H-107大孔樹脂對香椿葉黃酮動態解吸率的工藝參數為：解吸液體積分數64.88%，解吸液流速0.91 mL/min，解吸液體積99.11 mL，H-107樹脂的最優動態解吸率為87.21%（理論值為88.45%）。樹脂的動態吸附率達到85%以上，解吸率達80%以上。同此前報道的ADS-17大孔樹脂對竹葉總黃酮的吸附率為70.16%，解吸率為71.12%[14]相比，H-107大孔樹脂表現出對香椿葉總黃酮良好的吸附和解吸特性，并可用于科學研究和實際生產中香椿葉總黃酮的提取純化。

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