馬蘭中總黃酮提取及其抗氧化活性的研究

摘要：在單因素試驗基礎之上，結合正交試驗優化了超聲波輔助提取馬蘭（Kalimeris indica）總黃酮的工藝條件，并對馬蘭葉總黃酮的抗氧化活性進行研究。結果表明，用超聲波輔助提取馬蘭中總黃酮的最佳工藝條件為80%乙醇、超聲溫度75 ℃、超聲時間90 min、料液比1∶50（m∶V，g/mL），在該工藝條件下馬蘭總黃酮的提取率為3.57%。與常規抗氧化劑維生素C對比，馬蘭葉黃酮提取物具有較好的還原能力，并可以較好地清除羥基自由基（·OH）、超氧陰離子（O2-·）、ABTS正自由基離子（ABTS+·）。

關鍵詞：馬蘭（Kalimeris indica）；總黃酮；超聲波；抗氧化性

中圖分類號：S682.1+9；R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）16-4241-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.16.043

馬蘭是菊科馬蘭屬植物馬蘭（Kalimeris indica）的全草或根，又名馬蘭頭、馬蘭菜，為多年生草本植物。干燥全草入藥，新鮮莖葉可作蔬菜食用。主產于浙江、江蘇等地[1]。馬蘭營養成分豐富，除含有纖維素、糖類、蛋白質、脂肪等一般營養成分外，還含微量元素、胡蘿卜素和多種維生素[2]。馬蘭具有涼血、清熱、利濕、解毒及鎮痛抗炎等功效[3，4]，對保護視力、防止動脈硬化、防癌，治扁桃體炎、急性咽喉炎、蛇咬傷、瘧疾等均有重要作用。馬蘭中亦富含黃酮類化合物[5]，黃酮類化合物具有抗風濕[6]、抗菌作用[7]、免疫作用、抗氧化性[8]、治療心腦血管疾病等功能[9]。傳統的黃酮提取方法主要有有機溶劑提取法、回流提取法等，新興的方法主要有微波輔助提取法、超聲波輔助提取法與超臨界萃取法[10]。如今超聲波輔助提取法相對其他方法較為成熟，且有研究表明，超聲波可加速植物材料中的有效成分進入溶劑，從而提高提取率，縮短提取時間，避免高溫對提取成分的影響[11]。近年來，其應用方面的研究已有較多報道。因此，已有相關學者采用此法分別從甜蕎麥[12]、銀杏葉[13]、甘草[14]與無花果[15]中提取出黃酮類化合物。張燦等[5]優化出亞臨界水萃取馬蘭黃酮類化合物的方法；王貴軍等[16]用加熱回流法，以75%的乙醇為提取劑處理馬蘭葉粉，測得馬蘭黃酮的含量為2.83%。姜顯光等[17]用纖維素酶輔助熱浸提法提取的黃酮為30.60 mg/g，提取率為1.53%。本研究以超聲波輔助法提取馬蘭總黃酮，優化馬蘭總黃酮的超聲波提取工藝條件并探討馬蘭提取物的抗氧化活性，為進一步開發馬蘭資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬蘭產自陜西省漢中市陜西理工學院；蘆丁標準品；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、鄰二氮菲、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、硫酸亞鐵、過氧化氫、Tris、鄰苯三酚、ABTS、過硫酸鉀、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、維生素C，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器設備

AL204-IC型電子分析天平（梅特勒——托利多儀器上海有限公司）；722G型可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；KQ3200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；JXL-2S-6A型數顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市金祥龍電子有限公司）；101A-1型電熱鼓風干燥箱（中國重慶銀河試驗儀器有公司）；SHB-Ⅲ型循環水式真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；800型離心機（上海手術器械廠）。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備 采集馬蘭全株，洗凈，分離各部位。在60 ℃干燥箱中恒溫18 h后，取出冷卻至室溫后粉碎，過60目篩，用石油醚浸泡24 h后揮發石油醚，稱重，置于干燥器中備用。

1.3.2 標準曲線的制作 精確稱取0.050 2 g蘆丁標準品，用70%的乙醇溶解，定容至250 mL，得0.200 mg/mL蘆丁標準品溶液。準確吸取蘆丁標準品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0 mL于50 mL容量瓶中，加入5% NaNO2溶液1.5 mL，搖勻，放置6 min后加入10% Al（NO3）3溶液1.5 mL，搖勻，放置6 min后加入4% NaOH溶液20 mL，并用70%的乙醇溶液定容至刻度線，搖勻，10 min后于510 nm測定吸光度，用70%的乙醇溶液作為空白參比[18]。

1.3.3 總黃酮的提取與測定 精確稱取1.000 0 g脫脂干燥的馬蘭葉，按一定的料液比加入不同體積分數的乙醇溶液，在超聲波清洗器中（400 W）超聲波輔助提取一定時間，用真空泵抽提過濾，濾液即為馬蘭提取液。取5 mL馬蘭總黃酮提取液于50 mL容量瓶中，按“1.3.2”的方法，在510 nm條件下測定其吸光度，通過標準曲線計算馬蘭提取液中總黃酮的含量，再由下式計算馬蘭總黃酮提取率。

K=m×100%/M

式中，K為馬蘭黃酮提取率（%）；m為提取液中馬蘭黃酮質量（g）；M為馬蘭葉質量（g）。

1.3.4 單因素試驗

1）乙醇體積分數。準確稱取5份脫脂干燥的馬蘭葉各1.000 0 g，按1∶25的料液比（g∶mL下同）分別加入50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，在超聲波清洗器中于溫度70 ℃、功率400 W下超聲波輔助提取90 min，在510 nm波長處測定其吸光度，根據回歸方程計算出各處理的總黃酮提取量，并確定最佳乙醇體積分數。

2）溫度。準確稱取5份脫脂干燥的馬蘭葉各1.000 0 g，按的1∶25料液比加入80%的乙醇，分別在40、50、60、70、80 ℃下于超聲波清洗器中超聲波輔助提取90 min，確定最佳超聲波溫度范圍。

3）超聲時間。準確稱取5份脫脂干燥的馬蘭葉各1.000 0 g，按1∶25料液比加入80%的乙醇，在超聲波清洗器中于溫度70 ℃，功率400 W超聲波輔助提取30、60、90、120、150 min，確定最佳超聲時間范圍。

4）料液比。準確稱取5份脫脂干燥的馬蘭葉各1.000 0 g，分別按1∶15、1∶25、1∶35、1∶45、1∶55的料液比加入80%的乙醇，在超聲波清洗器中于70 ℃，功率400 W下超聲波輔助提取90 min，確定最佳料液比范圍。

1.3.5 正交試驗 在單因素試驗的基礎上，以馬蘭葉為材料，選取4個主要考察因素，即超聲溫度、超聲時間、料液比和乙醇體積分數，采用L9（34）正交試驗確定馬蘭葉中總黃酮的最佳提取工藝，因素與水平見表1。

1.3.6 馬蘭葉總黃酮抗氧化性的測定

1）對羥自由基（·OH）的清除作用。采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法[19]。10 mL離心管中分別依次加入 3.5 mL pH為7.4的10 mmoL/L PBS、1.5 mL 5 mmoL/mL鄰二氮菲，從第3支離心管開始依次加入1.0 mL不同質量濃度（0～0.039 27 mg/mL） 馬蘭總黃酮，再依次加入7.5 mmoL/L FeSO4 1 mL，最后從第2支離心管開始加入30 mmoL/L H2O2 1 mL，第1支離心管為未損傷管，第2支為損傷管。置于37 ℃恒溫水浴鍋中50 min，用蒸餾水定容至10 mL，在512 nm波長處分別測定各管的吸光度，平行測定3次，以維生素C（VC）為陽性對照，按照下式計算羥基自由基的清除率。

·OH清除率=■×100%

2）對超氧陰離子自由基（O2-·）的清除作用。采用鄰三苯酚自氧化法[20]。于10 mL的離心管中加入1 mol/L pH 8.2 Tri-HCl緩沖溶液5.0 mL，再依次加入用乙醇稀釋成不同濃度梯度的馬蘭總黃酮提取液，置于37 ℃水浴中10 min，再立即加入3 mol/L鄰苯三酚0.5 mL，置于室溫準確反應4 min，用蒸餾水定容至10 mL，于420 nm分別測定各管的吸光度，平行測定3次。在相同試驗條件下，不加任何提取液的吸光度為A空白，馬蘭總黃酮本身的吸光度為A0，以維生素C作陽性對照，按下式計算對超氧陰離子自由基的清除率。

O2-·清除率=■×100%

3）對ABTS自由基正離子（ABTS+·）的清除作用。采用ABTS法[21]。精確稱取0.096 0 g ABTS，加入25 mL 2.45 mmol/L過硫酸鉀后用超純水定容至50 mL，室溫置于黑暗中24 h，用無水乙醇稀釋，使其在734 nm處的吸光度為0.75；精確吸取5.0 mL上述自由基溶液于各離心管并依次加入質量濃度為0.357 mg/mL的馬蘭總黃酮提取液（0～30 μL），于30 ℃水浴10 min，在734 nm處測定吸光度Ax，以在734 nm處測定吸光度為0.75的自由基溶液吸光度為A0，用無水乙醇調零，平行測定3次，以維生素C作陽性對照，按下式計算對ABTS自由基正離子（ABTS+·）的清除率。

ABTS+·清除率=■×100%

4）還原能力的測定。采用Oyaizu[22]的方法測定馬蘭葉總黃酮的還原能力。于各個離心管中分別加入2.5 mL（pH 6.6）0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液和1%鐵氰化鉀溶液3 mL，再依次加入1.0 mL不同質量濃度（0～0.011 7 mg/mL）的馬蘭葉總黃酮，提取液混合均勻后置50 ℃水浴20 min后取出，然后加入 2 mL 10%三氯乙酸溶液3 000 r/min離心10 min。吸取上清液2.5 mL，加入蒸餾水2.5 mL和0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL。在700 nm處測定樣品的吸光度，以維生素C作陽性對照。吸光度越大，表示其還原能力越強。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線的建立

以蘆丁標品溶液濃度為橫坐標，所測吸光度為縱坐標作標準曲線（圖1），得其相關的回歸方程：y=10.183 x-0.001 2（R2=1）。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 乙醇體積分數對馬蘭總黃酮提取率的影響 由圖2可知，在乙醇體積分數低于80%時，提取率隨乙醇體積分數的增加逐漸增大，這是因為馬蘭總黃酮溶解度逐漸升高，使總黃酮提取率增大；當乙醇體積分數達到80%時，提取率達到最大，說明在該試驗條件下馬蘭總黃酮溶解度達到最大；從80%到90%，隨乙醇體積分數增加，總黃酮提取率卻逐漸降低，可能是體積分數過大，馬蘭中其他醇溶性物質溶出，抑制黃酮類物質溶出，從而導致總黃酮提取率下降。所以乙醇的體積分數選80%為宜。

2.2.2 超聲溫度對馬蘭黃酮提取率的影響 由圖3可知，馬蘭中總黃酮的提取率隨溫度的增加先升高后降低，在40～50 ℃隨溫度的增加提取率的增加較為緩慢，在50～60 ℃時增加較快，而后隨溫度增加提取率也逐漸降低，在超聲溫度為60 ℃時，馬蘭總黃酮提取率達到最大值。而之后總黃酮提取率隨溫度的增加而降低，可能是因為黃酮類分子被破壞。所以總黃酮的萃取溫度選取60 ℃為宜。

2.2.3 超聲時間對馬蘭黃酮提取率的影響 由圖4可知，隨著超聲時間的延長，提取率先增后減。在60 min以前，隨著超聲時間延長提取率也大幅度增加，這是因為隨著提取時間的增加總黃酮在乙醇溶液中逐漸溶出，所以提取率增大；當超聲時間達到60 min時提取率達到最大，而后緩慢降低，其原因可能是超聲時間加長，導致黃酮糖苷類發生水解，從而使總黃酮提取率下降。因此，提取時選擇超聲時間60 min為宜。

2.2.4 料液比對馬蘭黃酮提取率的影響 由圖5可知，隨著溶劑量的增加，在1∶15～1∶45，馬蘭總黃酮的提取率大幅度增加，到1∶45時增幅變緩，說明在該試驗條件下料液比1∶45適合總黃酮溶出。溶劑的增加會給后續處理增加困難，增加生產成本，因此在保證提取效果的同時，從經濟角度考慮，選擇料液比為1∶50為宜。

2.3 正交試驗結果

根據單因素試驗結果，選擇乙醇體積分數、超聲溫度、超聲時間與料液比4因素，采用L9（34）正交試驗優化超聲輔助乙醇提取馬蘭總黃酮的最佳提取條件。正交試驗的結果見表2。根據表2極差可知，各試驗因素對其影響主次順序為：A>D>B>C，即超聲溫度>乙醇體積分數>提取時間>料液比。綜合以上分析得出，超聲波輔助乙醇浸提馬蘭總黃酮的最佳因素水平為A3B3C2D2，即乙醇體積分數80%，超聲溫度75 ℃，超聲時間90 min，料液比1∶50。在此條件下進行3次平行試驗，測得平均提取率為3.57%。

根據正交試驗的最佳提取工藝，對馬蘭不同部位（根、莖、葉）進行總黃酮的提取并計算出各個部位的黃酮含量。測得結果為馬蘭葉總黃酮提取率為3.57%；馬蘭莖總黃酮提取率為0.880%；馬蘭根總黃酮提取率為0.435%，由此可以看出，馬蘭葉的總黃酮含量最高，次之為馬蘭莖，馬蘭根的總黃酮含量最低。

2.4 馬蘭葉總黃酮的抗氧化性

2.4.1 對羥自由基（·OH）的清除 從圖6可以看出，馬蘭葉總黃酮對·OH的清除活性趨勢從樣品濃度為0.003 6～0.024 2 mg/mL上升幅度劇烈，濃度為0.024 2～0.039 27 mg/mL上升幅度平緩。當樣品濃度達到0.039 27 mg/mL時，其對·OH的清除率達到最大，而維生素C對·OH的清除率最大僅為26.70%，說明馬蘭葉總黃酮對·OH的清除具有一定的量效關系，其清除效率強于維生素C。

2.4.2 對超氧陰離子自由基（O2-·）清除 超氧陰離子自由基由氧分子接收一個電子形成，可在生物體內長時間攻擊靶向目標，破壞細胞DNA，導致細胞內脂、蛋白氧化損傷，誘發氧化應激，繼而導致各種腫瘤、動脈粥樣硬化及中樞神經系統疾病等，所以研究清除超氧陰離子自由基很有必要[23]。由圖7可知，馬蘭葉總黃酮清除O2-·活性趨勢隨著樣品濃度的升高上升幅度劇烈，而維生素C增長幅度平緩。當樣品濃度為0.046 4 mg/mL時，馬蘭葉總黃酮對O2-·的清除率遠遠高于相同濃度條件下維生素C的清除率。說明馬蘭葉總黃酮清除O2-·活性明顯強于維生素C。

2.4.3 對ABTS自由基正離子（ABTS+·）清除 從圖8可以看出，樣品濃度在0～3.6 μg/mL時，ABTS+·的清除率與其存在良好的線性關系。隨著樣品濃度升高，ABTS+·清除率呈明顯的上升趨勢，而維生素C的上升趨勢不明顯。當樣品濃度為3.6 μg/mL時，其對ABTS+·清除率達到最大；而維生素C在此時對 ABTS+·清除率僅為34.65%；當樣品濃度為0.6 μg/mL時，維生素C對ABTS+·清除率小于5%；說明馬蘭葉總黃酮清除ABTS+·活性強于維生素C。

2.4.4 還原能力的測定 有研究表明[24，25]，還原力越強則自由基清除能力越強，也就是抗氧化活性越強，因此可通過測定還原力來說明其抗氧化活性的強弱。所以樣品吸光度越大，還原力越強。由圖9可以看出，馬蘭葉總黃酮有一定的還原能力。當樣品濃度為0.001 3 mg/mL，馬蘭葉總黃酮吸光度已達到0.4，說明馬蘭葉總黃酮在樣品濃度很低時就具有良好的還原能力。當樣品濃度達到0.011 7 mg/mL時，其吸光度是維生素C的2倍，表明馬蘭葉總黃酮總體還原能力強于維生素C。

3 小結與討論

在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗優化出超聲波輔助提取馬蘭總黃酮的最佳工藝條件為：80%乙醇、溫度75 ℃、時間90 min、料液比1∶50，此時，馬蘭總黃酮提取率為3.57%。通過抗氧化活性試驗，得到馬蘭具有較強的還原能力，對羥自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2-·）、ABTS+·都具有良好的清除能力，清除率優于常規抗氧化劑維生素C，清除羥自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2-·）、ABTS+·的EC50值分別為0.016 4、0.012 0 mg/mL和1.20 μg/mL。

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