珍稀瀕危植物寶華玉蘭ISSR—PCR反應體系建立及優化

摘要：為建立和優化寶華玉蘭（Magnolia zenii Cheng）ISSR-PCR反應體系，采用正交試驗和單因子試驗方法對影響PCR擴增體系中的Mg2+、dNTPs、DNA模板、引物和Taq聚合酶一定濃度的用量5個因子進行分析比較。結果顯示，寶華玉蘭ISSR-PCR 25 μL反應體系中的5個因子最佳水平分別為DNA模板（20 ng/μL） 3.5 μL，引物（10 μmol /L） 1.25 μL，Taq聚合酶（5 U/μL） 0.2 μL，Mg2+（25 mmol/L） 2.0 μL，dNTPs（2.5 mmol/L） 0.8 μL。寶華玉蘭ISSR-PCR反應的最優體系建立，為進一步利用ISSR對其進行分子標記輔助育種、分子身份證構建和遺傳多樣性分析等后續研究奠定了基礎。

關鍵詞：寶華玉蘭（Magnolia zenii Cheng）；ISSR-PCR反應體系；種質資源保護

中圖分類號：Q949.747.1+2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）16-4206-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.16.034

寶華玉蘭（Magnolia zenii Cheng）是木蘭科（Magnoliaceae）珍貴園林觀賞植物，在每年的3～4月開花，其芳香艷麗、姿態優美，有極高的觀賞價值。但其僅產自江蘇省句容縣寶華山，數量較少，已被列為國家二級重點保護植物。由于寶華玉蘭產地單一，對于環境的要求特別嚴格，所以人工栽培并成功的事例很少，同時由于林下灌木層不斷被破壞，沒有更新苗木，現已處于瀕危狀態[1]。面對如此嚴峻的形勢，開展對寶華玉蘭的遺傳多樣性分析研究、制定具有針對性的種質資源保護策略刻不容緩。簡單序列重復區間擴增多態性（Inter-simple sequence repeats，ISSR）是由加拿大蒙特利爾大學Zietkiewicz等于1994年創建的一種分子標記技術[2]，ISSR分子標記技術兼具SSR、RAPD、RFLP、AFLP等分子標記的優點，與其他技術相比，ISSR不需要預先獲知序列信息而使成本降低，且多態性更豐富；并且重復性高、穩定性好，同時具備簡便、易操作等特點；相比之下，ISSR更快捷、成本較低、DNA用量小、安全性較高[3]。由于上述優點，ISSR在植物種質資源研究尤其是種質資源的收集和鑒定、遺傳多樣性分析和親緣關系鑒別及基因定位等方面得到了廣泛的應用[4-9]。

目前對寶華玉蘭的研究，僅在形態學、生物生態學特性、生存現狀、文獻考證、群落學分析等方面有過初步研究和探索，對該物種在分子水平上的遺傳多樣性分析至今尚未見報道。試驗通過正交試驗和單因子試驗，分析DNA模板、Taq聚合酶、引物、Mg2+和dNTPs 5個因子用量對寶華玉蘭ISSR-PCR反應的影響，建立寶華玉蘭最優ISSR-PCR反應體系，以期為利用ISSR標記對其進行分子標記輔助育種、分子身份證構建和遺傳多樣性分析等后續研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所需的寶華玉蘭活體材料采自江蘇省句容縣寶華山。采取植物葉片后用硅膠快速干燥，妥善保存后送回南京森林警察學院實驗室。

1.2 方法

1.2.1 寶華玉蘭DNA提取 取硅膠干燥的植物葉片0.1 g，用研缽研磨粉碎，采用改良的十六烷基三乙基溴化銨（CTAB）法抽提基因組DNA[10]。DNA的濃度和質量采用紫外分光光度法和1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測。

1.2.2 寶華玉蘭ISSR-PCR反應引物篩選 引物參照加拿大哥倫比亞大學（UBC）網站公布的第九套ISSR引物序列進行合成。從100個ISSR引物中隨機選擇12條引物803、816、826、834、842、848、857、863、875、886、890、897進行目標引物的篩選。初反應體系為25 μL，其中Taq聚合酶（5 U/μL） 0.2 μL，Mg2+（25 mmol/L） 2 μL，DNA模板（20 ng/μL） 2 μL，dNTPs（2.5 mmol/L） 2 μL，引物（10 μmol/L） 1 μL，MilliQ水15.3 μL。擴增程序為：95 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共36個循環；72 ℃延伸10 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳進行擴增產物檢測。

1.2.3 寶華玉蘭ISSR-PCR反應體系建立 對寶華玉蘭ISSR-PCR反應的5因素（Taq酶、Mg2+、DNA模板、dNTPs、引物）4水平（濃度）設置正交試驗L16（45），共16個處理，每處理重復2次，建立寶華玉蘭 ISSR-PCR反應體系，具體信息見表1和表2。

1.2.4 寶華玉蘭ISSR-PCR反應單因子試驗設計 對正交試驗建立的ISSR-PCR反應體系進行單因子試驗（Mg2+、DNA模板、dNTPs、引物及Taq酶用量），分析不同因素對寶華玉蘭ISSR-PCR反應的影響；各單因子處理設置具體信息見表3。

2 結果與分析

2.1 目標引物確定

綜合比較電泳條帶的多態性、穩定性以及亮度，12條隨機引物2次重復的ISSR-PCR擴增電泳結果見圖1。從圖1可見，在12條引物中，以引物834的效果最好。故引物834被選定為目標引物進行正交試驗并建立寶華玉蘭ISSR-PCR反應體系。

2.2 寶華玉蘭ISSR-PCR正交試驗

基于引物834的寶華玉蘭ISSR-PCR 5因素4水平正交試驗結果見圖2。從圖2可見，16個處理中除12、13號處理無法擴增出條帶外，其他處理均能擴增出條帶，且每個處理重復效果基本一致。對有擴增結果的14個處理進行進一步比較，發現處理7的條帶最清晰，并且處理7的條帶多態性較好，故選取處理7對寶華玉蘭進行ISSR-PCR反應體系單因子試驗，分析不同因素對寶華玉蘭ISSR-PCR反應的影響，處理7的25 μL反應體系中：DNA模板（20 ng/μL）2.0 μL，Taq聚合酶（5U/μL）0.2 μL，引物（10 μmol/L）0.75 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）1.4 μL，Mg2+（25 mmol/L）1.2 μL。據此，對該體系進行單因子試驗濃度梯度設計（表2），并進行相應的 ISSR-PCR反應。

2.3 寶華玉蘭ISSR-PCR單因子試驗

圖3為不同DNA模板、引物、dNTPs、Mg2+濃度及Taq聚合酶用量單因子試驗對寶華玉蘭ISSR-PCR反應結果的影響。

2.3.1 DNA模板用量對寶華玉蘭ISSR-PCR反應體系的影響 最佳DNA模板用量取決于物種基因組大小及DNA模板的純度。試驗比較了25 μL反應體系中DNA模板（20 ng/μL）4個用量0.5、2.0、3.5、5.0 μL的效果，發現在正常情況下，隨著用量的增加，條帶亮度增加，擴增條帶多態性增強。因此寶華玉蘭ISSR-PCR反應體系中DNA模板（20 ng/μL）的用量在0.5～5.0 μL范圍時，以3.5 μL用量效果最佳。

2.3.2 引物用量對寶華玉蘭ISSR-PCR反應的影響引物用量會直接影響PCR結果的可靠性。用量偏大會引起錯配和非特異性擴增，且會增加引物二聚體的形成概率；用量過小則無法檢測出所有的ISSR位點。試驗引物用量（10 μmol/L）設置了0.25、0.75、1.25、1.75 μL 4個水平，結果表明（圖3），引物用量在1.25 μL時條帶最多且清晰，所以引物用量1.25 μL（10 μmol/L）是寶華玉蘭ISSR-PCR反應體系的最適用量。

2.3.3 dNTPs用量對寶華玉蘭ISSR-PCR反應的影響 dNTPs是ISSR-PCR反應的原料，用量過高，會導致PCR錯配，出現非特異性擴增條帶；反之則影響合成效率，甚至會因過早消耗而使產物單鏈化，影響擴增效果。試驗dNTPs用量（2.5 mmol/L）設置了0.8、1.4、2.0、2.6 μL 4個水平，結果（圖3）表明，在dNTPs用量為0.8 μL時，擴增條帶亮度和多態性最好，故寶華玉蘭ISSR-PCR反應體系中dNTPs最佳用量為0.8 μL（2.5 mmol/L）。

2.3.4 Mg2+用量對寶華玉蘭ISSR-PCR反應的影響 Mg2+用量對PCR擴增特異性和產物有顯著的影響。比較寶華玉蘭ISSR-PCR反應體系中0.4、1.2、2.0、2.8 μL（25 mmol/L） 4個Mg2+用量的電泳結果，當Mg2+用量為2.0 μL時，條帶多態性較豐富。因此寶華玉蘭ISSR-PCR反應體系中最適合的Mg2+用量應為2.0 μL（25 mmol/L）。

2.3.5 Taq聚合酶用量對寶華玉蘭ISSR-PCR反應的影響 Taq聚合酶用量直接影響擴增反應的成功與否，但Taq酶用量多不僅成本高，而且易產生非特異擴增產物；但如若Taq酶用量過低，則會導致產物合成效率下降。由圖3可見，Taq酶用量在0.05～0.50 μL（5 U/μL）范圍時，以0.20 μL用量效果最好，條帶最亮、多態性最豐富。

3 討論

ISSR是一種基于PCR的分子標記技術，而影響PCR反應的因素有多種，其中DNA是PCR反應的模板，dNTPs是PCR反應的原材料，引物與DNA靶序列結合引導PCR反應，Mg2+是Taq聚合酶的激活劑。因此，ISSR-PCR反應體系受DNA模板、dNTPs、引物、Mg2+和Taq聚合酶等因素及因素間相互作用的影響；不同反應體系中各因素水平的組合不同，也就產生了不同的ISSR-PCR反應結果[11-13]。為此，試驗采用正交試驗L16（45）及單因子試驗找出了各因素水平間的最優組合，并確定其為最佳反應體系。結果表明，DNA模板、Mg2+、dNTPs及引物的用量對寶華玉蘭ISSR-PCR擴增的影響較大，濃度過高或過低時常導致背景彌散或條帶缺失；而Taq聚合酶用量對擴增的影響較小，在設置的濃度范圍內條帶變化不大。

寶華玉蘭ISSR-PCR最佳反應體系的建立為利用ISSR標記對其實施進一步的分子標記輔助育種、DNA指紋圖譜構建和遺傳多樣性分析等后續研究奠定了基礎。

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