多粘芽孢桿菌中2，3—丁二醇脫氫酶的克隆和表達

摘要：將來自于多粘芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）中的2，3-丁二醇脫氫酶基因plaC在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21中進行了誘導表達，并對其酶學性質進行研究。結果表明，該基因的表達產物主要是生成內消旋型2，3-丁二醇，其氧化2，3-丁二醇的最適溫度是50 ℃，最適pH為10，而還原乙偶姻的最適溫度為60 ℃，最適pH為6。

關鍵詞：多粘芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）；2，3-丁二醇脫氫酶；乙偶姻

中圖分類號：Q813.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）16-4172-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.16.024

由于兩個手性碳原子的存在，2，3-丁二醇有3種異構體形式：D-（-）（左旋）、L-（+）（右旋）、meso （內消旋）。每種微生物常常合成兩種構型的2，3-丁二醇，如Aeromonas hydrophila和Bacillus subtilis可以生成meso-2，3-丁二醇和D-（-）-2，3-丁二醇；Klebsiella pneumoniae以及Serratia marcescens則生成meso-2，3-丁二醇和L-（+）-2，3-丁二醇（以前者為主）[1，2]。研究人員在研究相關微生物的基礎上提出了多種2，3-丁二醇構型的形成機制，如Ui等[3，4]最早提出了三酶催化假說，認為兩種2，3-丁二醇脫氫酶和乙偶姻外消旋酶可產生3種構型的2，3-丁二醇；而Ui等[5，6]提出了肺炎克雷伯氏菌中的2，3-丁二醇異構體形成模型，該模型認為乙偶姻外消旋酶是不存在的，是通過三種2，3-丁二醇脫氫酶催化而成。除了復雜的代謝途徑導致了2，3-丁二醇異構體混合物形成之外，微生物培養條件的改變也是導致2，3-丁二醇異構體形成的重要因素，Nakashimada等[7]、Ui等[8]發現pH和氧的供需也會影響2，3-丁二醇構型的形成。

以上各種模型和假說表明微生物細胞中2，3-丁二醇異構體形成機制的復雜性和多樣性，一定程度上為研究多粘芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）中2，3-丁二醇異構體的形成機制指明了一定的方向。

本研究致力于克隆多粘芽孢桿菌中存在的2，3-丁二醇脫氫酶基因，并且對其酶學性質進行表征，為探索和揭示多粘芽孢桿菌中2，3-丁二醇異構體形成機制奠定基礎，并為將來生產光學純2，3-丁二醇打下堅實的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 多粘芽孢桿菌NR1為實驗室自行篩選，大腸桿菌（Escherich coli）Top10購自上海生工生物工程技術服務有限公司，質粒pET28a為實驗室保存。

1.1.2 工具酶及試劑 限制性內切酶、連接酶及Taq酶均購自TaKaRa公司。抗生素及其他生化試劑均購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.1.3 培養基和抗生素 LB培養基（g/L）：酵母粉5；氯化鈉10；蛋白胨10；抗生素貯存母液濃度 （mg/mL）：氨芐青霉素100；卡那霉素50。

1.2 方法

1.2.1 2，3-丁二醇脫氫酶基因plaC的克隆 根據多粘芽孢桿菌的2，3-丁二醇脫氫酶基因序列設計引物，引物分別帶有相應的酶切位點以及保護堿基，以多粘芽孢桿菌NR1基因組DNA為模板，用引物plaCf和plaCr以高保真Primestar聚合酶進行PCR擴增，回收PCR產物，用相應限制性內切酶進行酶切，回收后與制備好的pET28a載體進行連接，連接產物轉化至大腸桿菌Top10感受態細胞中，在含卡那霉素的LB培養基平板上篩選重組子，得到重組載體pET28a-plaC。

1.2.2 誘導表達 將重組質粒pET28a-plaC轉化大腸桿菌感受態細胞BL21。從平板上挑取單菌落接種于50 mL的LB培養基（含50 μg卡那霉素）中37 ℃培養過夜。次日以1%（v/v）的接種量轉接入200 mL的LB培養基之中，37 ℃ 200 r/min培養2 h左右，當OD600達到0.5左右時，加入IPTG至終濃度為 1 mmol/L，在30 ℃搖床上進行誘導表達4 h以上。

1.2.3 2，3-丁二醇脫氫酶酶活力單位的定義以及酶活力的測定 從兩方面測定2，3-丁二醇脫氫酶酶活，一種是以2，3-丁二醇作為底物，以NAD+為輔酶，根據NAD+在整個反應過程中引起OD340的增加值來測定；另一個是以乙偶姻作為底物，以NADH為輔酶，根據NADH在整個反應過程中導致的OD340的降低來測定（表1）。

在最適溫度、最適pH下1 min還原1 μmol NAD+的酶量或者1 min將1 μmol的NADH氧化成NAD+的酶量為一個酶活單位，反應體系見表2。

1.2.4 酶反應最適pH的測定 用不同pH的緩沖液配制底物，共4種不同的100 mmol/L的緩沖液體系：HAc-NaAc（pH 4.0～5.8），磷酸緩沖液（pH 5.8～7.5），Tris-HCl（pH 7.5～8.6）和甘氨酸-NaOH（pH 9～12），稀釋酶液至合適的濃度，然后根據上述方法在最適溫度下測定2，3-丁二醇脫氫酶氧化2，3-丁二醇和還原乙偶姻的活性，每個試驗重復3次。

1.2.5 酶反應最適溫度的測定 在最適pH，分別測定稀釋到合適濃度的酶液在不同溫度（30、40、50、60、70、80、90 ℃）條件下氧化2，3-丁二醇和還原乙偶姻的活性，每個試驗重復3次。

1.2.6 酶動力學常數Km的測定 根據所測定的反應類型選擇其對應的最適溫度、最適pH。測氧化2，3-丁二醇反應使用100 mmol/L緩沖液、4 mmol/L的NAD+，反應體系中含有光學純2，3-丁二醇的濃度為5～100 mmol/L。測還原乙偶姻反應使用100 mmol/L緩沖液、0.2 mmol/L的NADH，反應體系中含1～10 mmol/L的（3R/3S）-乙偶姻。

1.2.7 酶的底物特異性研究 各光學純2，3-丁二醇和乙偶姻購自Sigma公司，其他醇和雙乙酰購自國藥公司，其中測定各種醇的氧化反應體系和條件與測定2，3-丁二醇氧化反應相同，而測定雙乙酰的反應體系和條件與測定乙偶姻的還原反應相同。

2 結果與分析

2.1 2，3-丁二醇脫氫酶基因在大腸桿菌中的誘導表達

通過PCR技術從多粘芽孢桿菌基因組中克隆到plaC基因，將其成功插入到pet28a表達載體上，將篩選得到的重組質粒轉化至大腸桿菌BL21菌株進行培養和誘導，SDS-PAGE檢測結果見圖1，可以看出該酶在大腸桿菌中成功表達。

2.2 2，3-丁二醇脫氫酶的最適反應溫度

使用純化所得到的重組酶蛋白plaC在不同的溫度下測定酶活性，分別測定酶氧化2，3-丁二醇和還原乙偶姻的最適反應溫度。由圖2可以看出，重組酶plaC氧化2，3-丁二醇的最適反應溫度為50 ℃，當溫度高于80 ℃時，酶活性急劇下降。該酶還原乙偶姻（圖3）的最適反應溫度是60 ℃，在70 ℃時，酶有超過60%的相對活性，而當溫度超過80 ℃時，酶的活性逐漸下降。

2.3 2，3-丁二醇脫氫酶的最適反應pH

根據不同的緩沖體系配制緩沖液，pH 4～12，測定重組酶plaC氧化2，3-丁二醇和還原乙偶姻反應的最適pH（圖4、圖5）。由圖4、圖5可以看到，重組酶plaC氧化2，3-丁二醇的最適反應pH為10，當pH為11時，酶有超過60%的相對活性，pH到12之后，酶的活性會急劇下降。該酶還原乙偶姻的最適反應pH為6，pH為7時，酶有70%的相對活性，pH超過7之后，酶活性會急劇下降，pH到9之后，該酶幾乎沒有還原乙偶姻的能力。

2.4 酶動力學常數Km的測定

按照方法中反應體系測定酶動力學參數，得到結果見表3。按照表3中反應體系，加入1 mg/L的純酶，測得2，3-丁二醇脫氫酶plaC相對于meso-2，3-butanediol的Km為3.42 mmol，Acetoin的Km為3.60 mmol。

2.5 酶的底物特異性研究

在最適溫度和最適pH下，分兩個方向測定該酶的底物特異性，一種是測定每個酶氧化醇類物質的底物特異性，另一種是還原乙偶姻類物質的底物特異性。結果如表4所示。從表4可以看出，脫氫酶plaC的最適底物是內消旋-2，3-丁二醇，幾乎沒有催化L-2，3-丁二醇和D-2，3-丁二醇的能力，結合該酶催化相應構型2，3-丁二醇的Km值，可以判斷plaC是內消旋型2，3-丁二醇脫氫酶。

3 小結與討論

將多粘芽孢桿菌中的2，3-丁二醇脫氫酶plaC在大腸桿菌BL21中進行了誘導表達并研究了其酶學性質。結果表明，該基因的表達產物主要是生成內消旋型2，3-丁二醇，其氧化2，3-丁二醇的最適溫度是50 ℃，最適pH是10，而還原乙偶姻的最適溫度為60 ℃，最適pH為6。以上結果表明發酵條件的改變會導致生產的2，3-丁二醇不同構型比例發生變化，此研究為進一步揭示多粘芽孢桿菌中不同構型的2，3-丁二醇形成機制和工業化生產光學純2，3-丁二醇奠定了良好的基礎。

參考文獻：

[1] VOLOCH M，LADISCH M R，RODWELL V W，et al. Reduction of acetoin to 2，3-butanediol in Klebsiella pneumoniae：A new model[J].Biotechnol Bioeng，1983，25（1）：173-183.

[2] TAYLOR M B，JUNI E. Stereoisomeric specificities of 2，3-butanediol dehydrogenase[J].Biochim Biophys Acta，1960，39（3）：448-457.

[3] UI S，TAKUSAGAWA Y，SATO T，et al. Production of L-2，3-butanediol by a new pathway constructed in Escherichia coli[J].Letters in Applied Microbiology，2004，39（6）：533-537.

[4] UI S，MASUDA T，MASUDA H，et al. Mechanism for the formation of 2，3-butanediol stereoisomers in Bacillus polymyxa[J].J Ferment Technol，1986，64（6）：481-486.

[5] UI S，HOSAKA T，WATANABE K，et al. Discovery of a new mechanism of 2，3-butanediol stereoisomers formation in Bacillus cereus YUF-4[J].J Ferment Bioeng，1998，85：79-83.

[6] UI S，MATSUYAMA N，MASUDA H，et al. Mechanism for the formation of 2，3-butanediol stereoisomers in Klebsiella pneumoniae[J].J Ferment Technol，1984，62：551-559.

[7] NAKASHIMADA Y，KANAI K，NISHIO N. Optimization of dilution rate， pH and oxygen supply on optical purity of 2，3-butanediol produced by Paenibacillus polymyxa in chemostat culture[J].Biotechnology Letters，1998，20（12）：1133-1138.

[8] UI S，MIMURA A，OHKUMA M，et al. Formation of a chiral acetoinic compound from diacetyl by Escherichia coli expressing meso-2，3-butanediol dehydrogenase[J].Lett Appl Microbiol，1999，28（6）：457-460.