芝麻餅殘油降解菌的選育誘變

摘要：從自然界土壤中采集到一株可降解芝麻餅殘油的菌種，經16S rDNA測定其序列后通過GenBank進行比對及聚類分析。結果表明，菌株16S rDNA長度為1 496 bp，聚類分析顯示與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的同源性達99%以上，該原始菌株經過以Co60為惟一放射源的輻射誘變，獲得突變菌，編號為MT-26。經測定，MT-26的酶活力可達725 U/mL，并對其進行傳代試驗，證明其具有良好的遺傳穩定性。

關鍵詞：殘油降解；放射誘變；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）

中圖分類號：Q939.9 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）16-4138-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.16.016

芝麻屬脂麻科，在中國是一種常見的經濟作物，是香油類生產的原料。由于香油的品相要求，芝麻在取油工藝上通常使用傳統的壓榨法取油，以保留香油最純正的味道[1]，然而通過傳統壓榨法取油后的芝麻餅中往往含有相當可觀的殘油量[2]。研究表明，芝麻油中的芝麻素是含量最高的木脂素[3]，由降解芝麻油而獲得的小分子脂類物質對調節動植物的生理代謝有比較顯著的作用[4，5]。本研究試圖對芝麻壓榨提油后剩余的餅粕中殘油加以利用，對其進行降解獲得有應用前景的小分子脂類，提高芝麻餅粕的附加值。筆者在自然界中廣泛篩選可有效降解芝麻餅殘油的菌株，并對其進行誘變和條件優化，為芝麻餅殘油降解菌在農業生產中的應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

土壤樣品于2013年2月20日采集于湖南長沙市芙蓉區東風屠宰廠，將采集土壤壓碎，去除石塊、植物根莖，混合均勻，裝入聚乙烯自封袋中，于泡沫冰盒中運輸及保存[5]。

初篩培養基：芝麻餅50 g/L，121 ℃滅菌25 min。顯色培養基：芝麻油20 g/L，FeSO4 0.1 g/L，葡萄糖10 g/L，（NH4）2SO4 0.1 g/L，MgSO4 0.1 g/L，NaCl 1 g/L，溴甲酚紫0.02 g/L（1.6%溶液），pH自然。LB培養基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂20 g/L。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選 1）菌株的初篩及分離純化：稱取適量處理后的土壤，加入90 mL培養基中進行搖瓶處理，置于37 ℃恒溫搖床中24 h[6]。發酵液搖勻后取1 mL，加9 mL滅菌水稀釋至10-2，后依次稀釋至10-6作不同的濃度梯度，并取200 μL加入制備好的LB培養基中涂布均勻，置于37 ℃培養箱中倒置培養，將培養出的細菌用畫線法挑選形態不同的菌斑且較大的菌株進行純化[7]。

2）產脂肪酶菌株的確認：由于脂肪酶降解脂肪后的主要產物為小分子脂肪酸（普通小分子脂肪酸pH為4.8～5.3），本試驗使用溴甲基紫作為培養基顯色劑，判斷菌株是否產生脂肪酶。將純化好的不同形態菌落接入篩選培養基，如在含溴甲酚紫的培養基中出現淡黃色顯色圈，而未接種的培養基內溴甲酚紫不變色，即可初步判定該菌株具有產脂肪酶能力[8]。

1.2.2 酶活力及生物量的測定 脂肪酶活力測定采用對硝基苯法[9]，酶活為40 ℃下每分鐘分解釋放出1 μmol對硝基苯酚的酶量，定義為一個活力單位（U）。生物量測定使用平板計數法。

1.2.3 菌株的鑒定 挑取單菌落接于1 mL無菌水中，置于100 ℃沸水浴10 min，5 000 r/min離心10 min，取上清液2 μL作為PCR模板，16S rDNA引物5′-AGGCAGCAGTAGG GAATCTT-3′，5′-CGTGGCTTTC

TGGTTAGGT-3′擴增產物交由華大基因公司進行測序。將獲得的序列提交GenBank進行比對，提取相似度最高的前5條序列使用MEGA5.05進行分析。

1.2.4 菌株的誘變 將初篩具有較高酶活的菌株置于含溴甲酚紫的顯色LB培養基中，送湖南省輻射中心進行放射量為60Gy的Co60放射誘變，將相同接種量的培養基用1 cm厚的均質鉛板隔絕直接放射后進行不同時間梯度的誘變。

1.2.5 發酵效果的測定 使用索式抽提法測定芝麻餅發酵前后的粗脂肪含量以測定發酵效果[10]。

2 結果與分析

2.1 菌株初篩結果

對試驗初篩獲得的128株有顯色圈的菌株（圖1），經精確測定菌落半徑與顯色圈半徑的比值后，挑選出30株菌株進行酶活力與生物量的測定，結果見表1。由表1可以看出，菌株酶活為68.203～264.321 U/mL，生物量為12×107～98×107 個/mL，進行測定后選擇8號菌株，并命名為MT菌進行下一階段試驗。

2.2 菌株的誘變

運用Co60對出發菌株進行放射誘變處理，由圖2可知，誘變4 h的菌株致死率達到80%，處理5 h致死率達到96%，為提高處理量和誘變效率，試驗選擇5 h作為誘變計量進行反復誘變。誘變篩選30株顯色圈較大的菌株進行下一步試驗。

挑選顯色圈較大的30株菌株，在LB培養基上培養24 h，反應條件為溫度37 ℃，振蕩速度120 r/min，采用對硝基苯酚法對培養物進行測定，獲得OD405 nm并計算酶活和生物量，結果見表2。

由表2可知，30株菌株的生物量維持為 28.97×107～208.61×107個/mL，酶活力為121.89～725.23 U/mL，其中26號菌株酶活力最高可達到725.23 U/mL，較原始菌株酶活上升263.67%。因此在進一步研究中選用菌株26，并命名為MT-26。

將MT-26菌株接種至試管斜面培養基（LB培養基）傳代10次，并測定每次傳代酶活力（表3），1～10代的脂肪酶活力為718～736 U/mL，酶活力變化為3.84%，小于5%，說明該菌株具有相對穩定的遺傳性。

2.3 測序鑒定

將菌株MT-26的PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳后送至華大基因科技有限公司進行測序。測得MT-26菌株的16S rDNA的序列長度為1 496 bp，其MEGA5.05聚類分析結果見圖4。

3 小結與討論

近年來隨著芝麻油的暢銷及芝麻產量的上升，其榨油副產物芝麻餅粕的產量也不斷增加，而傳統的處理芝麻餅粕的方法普遍用作動物飼料或者植物基肥[11，12]。芝麻餅中富含豐富粗脂肪、粗蛋白等，直接使用效果較差，造成一定的資源浪費[13]。本試驗通過篩選獲得能夠降解芝麻餅粕中殘油的菌株，并對其誘變和培養條件進行初步探索，以期提高芝麻油產品的附加值；通過對大量的菌種篩選，從富含油脂的土壤中分離篩選出一株可以降解芝麻餅中粗脂肪的菌株，對出發菌株進行Co60放射誘變，獲取了一株可以穩定遺傳的產脂肪酶菌株，命名為MT-26，基因比對結果顯示該菌株是一種枯草芽孢桿菌。由于芝麻餅既富含碳源、氮源等營養物質，又含有多種無機鹽類物質，試驗中在進行菌種篩選時僅使用芝麻餅與水作為搖瓶培養基，為特異性改造可降解芝麻餅粕的菌株作準備。本研究獲得的誘變菌株MT-26酶活達到725.23 U/mL，較誘變前有明顯的提高，對誘變后的菌株進行傳代測定，證明其有良好的遺傳穩定性。下一步試驗將對菌株MT-26進行培養基條件優化及小規模發酵條件的摸索和優化。

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