藥用植物扁桃斑鳩菊的離體快速繁殖技術研究

摘要：以扁桃斑鳩菊（Vernonia amygdalina Del.）莖段為外植體對其進行離體培養與快速繁殖技術研究。結果表明，外植體表面消毒以75%乙醇預處理10 s，再用0.1%氯化汞浸泡8 min效果最好；繼代培養的最適宜培養基為MS+0.2 mg/L 6-BA+0.05 mg/L IBA，增殖系數可達4.0；最適宜的生根培養基為1/2MS+0.10 mg/L IBA，生根率可達100%；光照度為1 500～2 500 lx時，組培苗生長健壯；將生根后的植株進行移栽，在輕基質中或黃心土中成活率均可達90%以上。

關鍵詞：扁桃斑鳩菊（Vernonia amygdalina Del.）；組織培養；快速繁殖；光照度

中圖分類號：Q949.783.5；R282.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）19-5087-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.19.049

Abstract：The techniques of tissue culture and rapid propagation of Vernonia amygdalina Del. were studied by using the stem as explants. The results showed that the most suitable procedure for sterilization was to disinfect with 75% alcohol for 10 seconds，and then soaked explants into 0.1% HgCl2 solution for 8 minutes. The best media for propagation was MS+0.2 mg/L 6-BA+0.05 mg/L IBA and the coefficient of propagation achieved 4.0. The best rooting media was 1/2MS+0.1 mg/L IBA，and the rooting rate achieved 100%.The tissue culture seedlings grew well when the illuminance was set between 1 500 to 2 500 lx. The rooted plantlets were transplanted into the substrate or yellow soil and the survival rate were both over 90%.

Key words： Vernonia amygdalina Del.； tissue culture； rapid propagation； illuminance

扁桃斑鳩菊（Vernonia amygdalina Del.）又名桃葉斑鳩菊、神奇葉、苦樹、南非樹等，為菊科斑鳩菊屬植物，原產于非洲。扁桃斑鳩菊多為喬木或小灌木，喜光，宜在潮濕環境中生長，也耐干旱，適應所有土壤類型。扁桃斑鳩菊葉子可以安全食用，在尼日利亞等地被當作一種蔬菜。其葉片具有獨特的氣味和苦澀感，因而常被稱為苦葉[1]，可作為殺菌劑或啤酒花的替代品[2]。目前已從中分離5類共32種化合物，其主要活性成分有皂苷、生物堿、萜類、類固醇、香豆素類、黃酮類、酚酸類、木酚素、蒽醌類和倍半萜等，在治療腫瘤尤其是防治乳腺癌、降血壓方面極具潛力[1]。扁桃斑鳩菊在東南亞及中國臺灣等地民間應用較多，而中國大陸則相對比較少，近年來兩廣地區陸續有引進，在藥用成分提取、保健品開發和食療方面具有極大的開發潛力。采用組織培養技術建立其無性快繁技術體系，相對常規扦插技術，可以實現周年生產、有利于種質資源保存和推進其產業化發展，也為更深層次的研究提供了技術平臺。因此，本試驗對扁桃斑鳩菊的組織培養快速繁殖技術進行研究，以期為扁桃斑鳩菊的產業化發展提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

材料來源為廣西壯族自治區欽州市林業科學研究所實驗苗圃栽培的扁桃斑鳩菊。選取生長健壯、無病蟲害的優良植株，剪取木質化程度較輕的當年生嫩枝為外植體。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體消毒 將采回的莖段截成長1.2～1.5 cm的帶節小段，剪去葉片，只保留葉柄基部（長約0.5 cm），流水沖洗20 min備用。在超凈工作臺上，用75%乙醇浸泡10 s，0.1%氯化汞振蕩消毒5～12 min，再用無菌水沖洗5次洗去殘留藥液，用無菌濾紙吸干水分后，切去莖段兩端和葉柄上部少許（長約0.2 cm），接種于誘導培養基上。氯化汞消毒時間設定為5、8、10和12 min，每種處理20個外植體，篩選出最佳滅菌時間。

1.2.2 培養基配方設計 誘導培養基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA。繼代培養時，以MS為基本培養基，添加6-BA（0.1～0.5 mg/L）、NAA（0.01～0.05 mg/L）或IBA（0～0.05 mg/L）等不同植物生長調節劑濃度組合，進行培養。生根培養時，以1/2MS為基本培養基，添加不同濃度的NAA（0.05～0.15 mg/L）或IBA（0.05～0.15 mg/L），進行培養。

1.2.3 培養條件 除特別說明外，上述培養基均添加3.0%蔗糖和0.6%瓊脂粉，pH 5.8～6.0。培養室培養溫度為（23±2） ℃，繼代培養光照時間12 h/d，光照度1 500～2 500 lx；生根培養光照時間16 h/d，光照度1 500～2 500 lx。

1.2.4 培養過程 將消毒完成后的外植體接種于誘導培養基中，定期觀察記錄消毒結果，記錄內容包括消毒外植體數、消毒時間過長造成的外植體死亡數、外植體霉菌細菌污染數、外植體成活數和側芽的生長情況。3周后將記錄結果進行統計，取各組的平均值作為試驗結果。誘導率=（出芽外植體數/接種數）×100%。

繼代和生根均用手術刀和鑷子進行操作。待無菌芽生長至2～3 cm時，轉入繼代培養基進行培養，培養周期為21 d。在同一培養基中連續培養2個周期，待增殖苗生長穩定后，觀察芽的生長情況。每種處理為150個接種芽，隨機抽取30個接種芽，統計增殖系數，篩選最適宜的增殖培養基。增殖率=（增殖株數/接種數）×100%，芽增殖系數=增殖芽數/出芽株數。

取帶有2～3個節的試管苗頂端轉入生根培養基進行培養，截取長度約3 cm，每種處理為150株。生根培養2周后，隨機抽取30株組培苗，統計植株高度、葉色、生根率、平均生根數等生長指標，篩選最佳的生根培養基。生根率=（生根株數/接種數）×100%；平均生根數=生根數量/接種株數。

1.2.5 不同光照度對組培苗長勢的影響試驗 選60瓶增殖苗，分為3組，每組20瓶，分別置于不同光照度下連續培養2個生長周期（每個生長周期均為3周），觀察記錄不同光照度下扁桃斑鳩菊的生長情況。光照度設置為500、500～15 00、1 500～2 500 lx。

1.2.6 不同栽培基質對扁桃斑鳩菊移栽苗生長的影響 將完成生根階段的試管苗，洗干凈基部的培養基，分別種植于輕基質（泥炭∶珍珠巖=2∶1）和黃心土中。分別移栽500株，3周后統計移栽成活率。

2 結果與分析

2.1 無菌材料的獲得

從表1可以看出，隨著在0.1%氯化汞溶液中消毒時間的增加，外植體死亡數量也隨之增加，而污染數量隨之減少，外植體成活率呈現先升高再降低的態勢。消毒死亡的外植體外觀呈現出黑褐色，很難再抽出新芽；少量外植體呈現黑綠相間的顏色，一部分仍可抽出新芽；消毒時間為5 min時，雖然外植體仍為綠色，且多有側芽抽出，但污染率高達75%。綜合考慮外植體死亡率、污染率和成活率等各方面因素，氯化汞消毒處理8 min最為適宜。

在誘導培養基中，會在外植體的莖桿表面或莖桿基部出現愈傷組織，但大多呈現水漬狀且質地疏松，很難誘導出芽，而側芽則易于誘導且生長迅速（圖1-A）。初代培養3周時，側芽可高達3～4 cm，具3張以上葉片（圖1-B），轉入增殖培養基進行繼代培養。

2.2 扁桃斑鳩菊的繼代培養

扁桃斑鳩菊生長迅速，培養3周即可進行下一次繼代，超過4周易出現黃葉和小芽死亡的情況，影響增殖效率。扁桃斑鳩菊對植物生長調節劑的種類和濃度比較敏感，如表2所示，當6-BA濃度達到0.3 mg/L時容易出現玻璃化現象，當濃度達到0.5 mg/L時，玻璃化現象尤為嚴重，且基部水浸狀愈傷組織較多；6-BA濃度為0.1 mg/L時，植株生長細弱，節間長，基部分枝少，影響切割效率和種苗質量；當6-BA濃度為0.2 mg/L時，植株生長健壯（圖1-C），且6-BA和IBA配合使用時，試管苗的生長狀況最佳。因此選用MS+0.2 mg/L 6-BA+0.05 mg/L IBA為扁桃斑鳩菊繼代的最適宜培養基。

2.3 扁桃斑鳩菊的生根誘導

扁桃斑鳩菊生根培養2周時，觀察統計各組培養基的試驗效果。統計生根數量時，長度達到0.5 cm及以上的肉質根方可計入生根數。由表3可知，以1/2MS為基本培養基附加濃度0.05～0.15 mg/L的NAA或IBA均可取得較高的生根率，且平均生根數都在5條以上，說明扁桃斑鳩菊的生根誘導較為容易。但采用NAA誘導時，雖然已經降低了基本培養基中無機鹽的用量，但仍會出現不同程度的愈傷組織和玻璃化現象，不利于試管苗的移栽。采用IBA誘導生根時，以1/2MS+0.10 mg/L IBA誘導生根的效果最好，根系最為發達，小苗的長勢最好，最適合后期移栽（圖1-D、1-E）。

2.4 不同光照度對扁桃斑鳩菊增殖苗生長的影響

對組培苗增殖階段進行報紙覆蓋、調整日光燈數量等措施設置不同光照度，每天光照時間12 h，培養3周后，進行觀察統計。從表4可以看出，在散射光條件下（約500 lx），增殖苗較細弱，節間較長，葉片嫩綠色，有玻璃化現象，基部有水漬狀愈傷組織，長勢較差；光照度為500～1 500 lx時，增殖苗長勢一般，少量葉片有玻璃化現象；光照度為1 500～2 500 lx時，增殖苗生長正常，植株健壯，無玻璃化現象和愈傷組織產生。

2.5 不同栽培基質對扁桃斑鳩菊移栽苗生長的影響

生根培養2周，生根苗高度可達4～6 cm，平均根長2～3 cm，即可進行移栽（圖1-F）。移栽應在遮陰度75%的溫室或者簡易陰棚內進行，移栽初期保持較高的空氣濕度。3周后，分別統計種植在輕基質（泥炭∶珍珠巖=2∶1）和黃心土中的小苗成活率，結果見表5。由表5可知，扁桃斑鳩菊的移栽苗在黃心土和輕基質中成活率均可達到90%以上，輕基質中成活率稍高，達96.6%。

3 小結與討論

目前已知的斑鳩菊屬植物約1 000種，主要生長于熱帶地區，中國已發現約30種，主要分布于西南、東南和新疆等地。目前該屬植物的研究重點主要集中在抗腫瘤活性、對免疫系統影響、皮膚病治療和抗感染等藥理學方面，尤以新疆阿克蘇地區的中藥材——驅蟲斑鳩菊的研究為多。關于該屬植物生物學特性、親緣關系、繁殖方法等方面的研究較少，如何加強相關基礎研究、構建現代生物技術研究平臺，對加速推進該屬植物的產業開發尤為重要。

扁桃斑鳩菊生長迅速，繼代苗的培養周期僅為3周，但容易出現玻璃化現象。繼代初期，參照胡石開等[3]驅蟲斑鳩菊的組培技術，試驗了培養基MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，結果其試管苗玻璃化嚴重，且大多不可逆轉。后進一步試驗顯示，當增殖培養基中6-BA的濃度超過0.3 mg/L時試管苗的玻璃化就較為普遍，表現為試管苗生長異常，葉片和嫩梢呈透明或半透明的水浸狀，葉片皺縮、僵硬、易碎，且有水浸狀愈傷組織形成。本試驗結果顯示在培養基MS+0.2 mg/L 6-BA+0.05 mg/L IBA 中，扁桃斑鳩菊增殖系數達到4.0，且小苗生長健壯。

玻璃化現象是組織培養過程中常見的現象之一，與菌類污染、褐變并稱為三大難題[4]。一般認為影響玻璃苗發生的因素主要有培養材料、培養環境、培養基成分、碳源和植物生長調節劑等[5]。本試驗中，除了調控外源植物生長調節劑外，還采取了多方面措施來解決試管苗的玻璃化問題。培養材料的來源，采用腋芽誘導而非愈傷組織再分化成苗的途徑，保證了組培苗的品質；繼代培養環節中，通過不同光照度試驗，設定光照度為1 500～2 000 lx；生根培養環節，采用降低基本培養基中大量元素、延長光照時間至16 h等方法，有效解決了試管苗的玻璃化問題。

NAA和IBA是誘導組培苗生根的最常用植物生長調節劑，但誘導生根的效果并不完全相同。吳明鋼等[6]在霍山石斛的莖段培養中發現，NAA與IBA配合使用時，當IBA含量較高時有利于誘導出芽，反之有利于誘導生根，IBA似有細胞分裂素的作用。王喆之等[7]在研究槐樹試管苗生根時，就不同生長素種類對誘導的不定根來源、形態方面進行了專門研究。研究結果顯示，IBA、NAA對不定根發生、生長都有促進作用，但IBA誘導的不定根細而長，生長快，且不定根直接來源于莖，而NAA誘導的根短而粗，且不定根表面常重新愈傷化，不利于試管苗成活。在金葉薹草等植物的組培育苗過程中也曾發現類似的現象，IBA誘導出的根較細長，而NAA誘導的根較為粗壯且更易產生愈傷組織[8]。扁桃斑鳩菊的試管苗生根較易誘導，不同濃度（0.05～0.15 mg/L）的NAA和IBA生根誘導率均可達90%以上。綜合扁桃斑鳩菊組培苗的生長情況、生根率和生根系數等情況，篩選出1/2MS+0.10 mg/L IBA為其生根的最佳培養基配方。

扁桃斑鳩菊的移栽苗在黃心土和輕基質中成活率均可達到90%以上，輕基質中成活率稍高（96.6%），且生長快，根系發達；黃心土中植株生長稍慢，但小規模經營時，投資小、取材方便，具有一定優勢。選擇輕基質還是黃心土進行移栽，需要結合市場需求、生產規模、運輸距離等因素進行成本核算和風險分析。

參考文獻：

[1] 楊 早.南非葉化學成分及藥理作用研究進展[J].南京中醫藥大學學報，2013，29（4）：397-400.

[2] 孫東方.扁桃斑鳩菊甲醇提取物對高粱糖化及釀造特性的影響[J].釀酒，1998（1）：66-68.

[3] 胡石開，王曉軍，郝秀英，等.驅蟲斑鳩菊的組織培養與快速繁殖[J].植物生理學通訊，2008，44（2）：310.

[4] 趙鵬暉，張江濤，馬紅衛.植物組織培養中的幾個常見問題與對策[J].河南林業科技，2001，21（2）：27-28.

[5] 蔡祖國，徐小彪，周會萍.植物組織培養中的玻璃化現象及其防治[J].生物技術通訊，2005，16（3）：353-355.

[6] 吳明鋼，康春鳳，魯潤龍.霍山石斛帶節間的莖段在IBA/NAA誘導下的組織培養[J].中國科學技術大學學報，2001，31（5）：624-628.

[7] 王喆之，胡正海. IAA，IBA，NAA和2，4-D對槐樹試管苗生根的影響[J].陜西師范大學學報（自然科學版），1997，25（2）：57-59.

[8] 王華宇，何貴整，陳乃明，等.金葉苔草標準化繁育技術研究[J].上海農業學報，2013，29（4）：64-67.