軟棗獼猴桃離體快速繁殖技術

摘要：以軟棗獼猴桃（Actinidia arguta）枝條萌發的幼芽為外植體，以MS為基礎培養基，添加不同質量濃度的細胞分裂素6-BA、生長素NAA和IBA，探索了軟棗獼猴桃的離體快速繁殖技術。結果表明，軟棗獼猴桃叢生芽增殖的最佳培養基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA+30 g/L蔗糖，pH為5.8～6.0，在此條件下，其平均增殖系數為4.69，且誘導的無菌苗健壯；最適生根培養基為1/2MS+0.4 mg/L IBA+30 g/L蔗糖+2.0 g/L活性炭，生根率達100%，且根系健壯、數量繁多。

關鍵詞：軟棗獼猴桃（Actinidia arguta）； 離體快速繁殖；叢生芽增殖

中圖分類號：S663.4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）19-5007-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.19.027

Micropropagation in vitro of Actinidia arguta

ZHAO Rui1，ZHAO Chun-li1，AN Bai-yi1，DONG Ran1，WANG Ke-feng2，GU De-feng1

（1.College of Horticulture， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China；

2.Changchun University of Science and Technology， Changchun 130600， China）

Abstract： Using bud of Actinidia arguta branches germination as explants，with MS as basic culture medium by adding different mass concentration cytokinin 6-BA， auxin NAA and IBA，the micropropagation in vitro technology of A. arguta was explored. The results showed that the optimum proliferation medium of shoot cluster was MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA+30 g/L sucrose，and pH was 5.8 to 6.0. Under this condition，the average multiplication coefficient was 4.96 with vigorous aseptic seedling. The best rooting medium was 1/2MS+0.4 mg/L IBA+30 g/L sucrose+2.0 g/L activated carbon，at these condition，the rooting rate was 100%，and the roots were well developed and had great quantity.

Key words： Actinidia arguta； micropropagation； shoot cluster multiplication

軟棗獼猴桃（Actinidia arguta Planeh.）屬于獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia），為多年生落葉藤本植物。具有非常高的營養價值，富含蛋白質和多種礦物質，尤其維生素C的含量很高。能有效提高人體的免疫力、有降血壓、降血脂、美容健美的功效[1，2]。并且在園林應用中，由于其樹形優美、果實奇特，可以作為觀賞樹種設計成花架或花棚，是極具商業化發展前景的觀賞型果樹之一[3]。

隨著野生資源引種馴化工作的逐步進行，對于軟棗獼猴桃優質品種的苗木需求量急劇增加[4，5]，并且軟棗獼猴桃生產栽培應用較少，多數為野生狀態，由于長期處于野生狀態，資源面臨枯竭[6]。軟棗獼猴桃種子繁殖遺傳變異大，采用綠枝扦插的常規無性繁殖法，存在繁殖系數低、速度慢、植株取材受季節限制嚴格等問題，影響優良品種的開發和利用[5，7]。因此，本試驗以軟棗獼猴桃的腋芽為原材料，采用離體快速繁殖技術，快速高效地生產優質的軟棗獼猴桃植株，為其大規模生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料來源

試驗材料采自吉林省吉林市山區，從果實飽滿、味道鮮美、長勢健壯、形態優美、產量高、雌雄異株的野生雌株軟棗獼猴桃上選取優良枝條，試驗室水培催芽20 d左右，腋芽陸續萌發，取萌發的腋芽為培養外植體。

1.2 外植體滅菌

將長至大約1.3 cm的腋芽放入滅過菌的燒杯中，在超凈工作臺上，用0.05%的氯化汞分別滅菌2、3、4、5 min后用無菌水沖洗6～8次，將獲得的無菌外植體接入MS基礎培養基中。

1.3 叢生芽增殖培養基

分別添加不同質量濃度的6-BA（1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L）及IBA（0.1、0.2、0.3、0.4 mg/L）至含20 g/L蔗糖的MS培養基中，同時以不添加生長調節劑的MS培養基作為對照。每種處理45個，重復3次，接種30 d時觀察組培苗的生長狀態，并統計叢生芽的增殖系數。

1.4 壯苗培養基

以MS為基本培養基，添加不同濃度有機添加物進行壯苗培養試驗。分別添加蔗糖（30、40 g/L）；蔗糖15 g/L +蜂蜜15 g/L；蜂蜜（20、30 g/L）；白砂糖30 g/L；葡萄糖30 g/L；蛋白胨100 g/L。以MS+20 g/L蔗糖為對照（CK），每種處理45個，重復3次，篩選出最適合軟棗獼猴桃叢生芽壯苗的培養基。

1.5 生根培養基

當無菌苗長至2～3 cm，將其分別接種于不同質量濃度IBA（0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L）、NAA（0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L）和活性炭（0、1.0、2.0、3.0 g/L）的1/2 MS 生根培養基中，進行生根培養，以不添加生長調節劑的1/2 MS培養基為對照，每種處理45個，重復3次，30 d時調查無菌苗的生根及生長情況。

1.6 培養條件

pH 5.8～6.0，溫度（23±2） ℃，光照3 000 lx，光周期14 h/10 h（光培養/暗培養）。

1.7 統計方法

試驗中所有數據采用Excel和DPS 14.5軟件進行方差分析和多重比較。成活率=（成活芽數/接種芽數）×100%；污染率=（污染芽數/接種芽數）×100%；增殖系數=（再生芽總數/接種芽數）；平均根數=生根總數/生根苗數；平均根長=根的總長度/根的總條數。

2 結果與分析

2.1 滅菌時間對外植體污染率的影響

軟棗獼猴桃腋芽經過不同時間的滅菌后培養，試驗10 d時觀察外植體的污染情況，30 d時觀察外植體的成活情況（圖1），從而選出軟棗獼猴桃的最佳滅菌時間。結果表明，隨著滅菌時間的延長，外植體的污染率有所下降，但在滅菌時間為5 min時成活率出現下降（表1）。這是由于隨著處理時間增加，有利于降低污染，但當處理時間超過一定限度時，會損害植株，滅菌時間為4 min時污染率和成活率最宜。故軟棗獼猴桃腋芽在0.05%的氯化汞中的最佳滅菌時間是4 min。

2.2 不同質量濃度的6-BA和IBA對叢生芽增殖的影響

將初代培養的無菌幼苗切取頂芽1.5 cm左右，接種于不同質量濃度配比的培養基中進行叢生芽的增殖培養，接種16 d后，幼苗底部開始長出新的小幼芽，30 d時新生的叢生芽長至2～4 cm（圖2）。結果表明，不同質量濃度配比的6-BA和IBA對叢生芽增殖存在極顯著差異（P<0.01）。由表2可知，6-BA和IBA質量濃度分別為2.0、0.2 mg/L時，增殖系數達到最大值，為4.69，并且幼芽生長健壯，葉色濃綠。

2.3 不同質量濃度的蔗糖、蜂蜜、白砂糖、葡萄糖和蛋白胨對叢生芽壯苗的影響

將繼代增殖培養的叢生芽接種于上述最佳生長調節劑，再分別加入不同質量濃度的蔗糖、蜂蜜、白砂糖、葡萄糖和蛋白胨的培養基中，培養30 d時觀察叢生芽壯苗情況。由表3可以看出，蔗糖和蜂蜜的濃度對叢生芽增殖和健壯程度都有一定的影響。結果表明，添加30 g/L蔗糖和添加30 g/L蜂蜜均與其他濃度的處理（除20 g/L蜂蜜外）呈極顯著或顯著差異，但二者之間對叢生芽增殖的影響差異不顯著。添加30 g/L蔗糖的叢生芽增殖系數為4.70且葉片濃綠有光澤，叢生芽莖粗壯，長勢健壯；添加30 g/L蜂蜜的叢生芽增殖系數為4.76，但其莖纖細，長勢較弱，葉片小而且少量卷曲，呈淡綠色。白砂糖和葡萄糖對叢生芽增殖的影響較小，加入蛋白胨的培養基無明顯現象，故軟棗獼猴桃最佳的壯苗培養基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA+30 g/L蔗糖的培養基。

2.4 生根培養

2.4.1 植物生長調節劑對生根的影響 在繼代培養中選取長至2～3 cm生長健壯、長勢一致的無菌苗進行生根試驗。試驗以1/2MS為基本培養基，分別添加不同質量濃度的NAA（0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L）、IBA（0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L），培養30 d時統計生根情況，具體結果見表4。由表4可知，添加NAA的培養基中，根部出現了大量褐色的愈傷組織，并且根都較脆弱易折斷，須根多且細，隨著NAA濃度的增加，平均生根數下降；添加IBA的培養基中，0.4 mg/L IBA的生根率最高可達到100%，平均生根數也最高，與其他IBA質量濃度處理存在極顯著差異，并且根呈綠色，堅韌粗壯，較少有愈傷組織（圖3），隨著IBA濃度的增加，平均生根數降低且根逐漸變細，顏色變淡，出現愈傷組織的機率不斷增加，并且愈傷組織也隨之增大。故生根最好的生長調節劑配比為1/2MS+0.4 mg/L IBA。

2.4.2 活性炭對生根的影響 將繼代培養的無菌苗接種于上述生長調節劑最適宜的生根培養基中并且加入不同質量濃度的活性炭，培養30 d時統計生根情況。由表5可知，添加1.0、2.0 g/L活性炭與不添加活性炭的平均生根數差異不顯著，但添加2.0 g/L活性炭的植株無愈傷組織且植株健壯，根堅韌粗壯（圖4）。繼續增加活性炭含量，發現雖然平均根長增加但根系質量下降，細且易斷，有較多的褐色愈傷組織并且生根數明顯減少。故1/2MS+0.4 mg/L IBA+30 g/L蔗糖+2.0 g/L活性炭為生根的最佳培養基。

3 討論

在利用組織培養進行軟棗獼猴桃離體快速繁殖過程中，使用植物生長調節劑是提高幼芽增殖系數的重要因素之一[8，9]。劉長江等[10]對野生軟棗獼猴桃莖尖培養研究發現，生長調節劑濃度為2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA對叢生芽增殖的效果顯著，叢生芽形成的最多，增殖系數最大，與本試驗的結果基本一致。為使繼代培養的無菌苗長勢健壯并且增殖系數大，在繼代培養基中添加蔗糖、蜂蜜、白砂糖、葡萄糖和蛋白胨等有機添加物。培養基中添加蜂蜜在軟棗獼猴桃的組織培養中尚未見報道，雖然其增殖系數最大，但長勢較弱，不適宜添加在壯苗階段。生根質量可直接影響移栽成活率[11]，本試驗在篩選出有利于生根的生長調節劑基礎上添加2.0 g/L活性炭有效地提高了生根質量，使根系健壯，根部堅韌粗壯不產生愈傷組織。這與王大平等[12]對獼猴桃組培苗生根培養的研究結果相似。

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