月季抗根癌病和根腐病復合砧木的預選

摘要：為獲得抗月季根癌病、根腐病復合砧木品種，以R及4倍體薔薇雜交獲得的3株雜交后代為試材，進行了根癌病、根腐病抗性鑒定、扦插成活率及嫁接親和性試驗。結果表明，3株雜交后代的腫瘤形成率約為20%，具有較強的根癌病抗性；插穗褐變度為20%左右，顯著低于感病品種R，具有較強的根腐病抗性；扦插成活率為70%左右，達到了生產上的要求；雜種后代R

5嫁接成活率為80%，其他兩個后代達到了100%。結合枝條綜合性狀考慮，雜交后代R. hybrida×multiflora F1 No.1生長勢強，枝條伸長性好，少刺，有望成為抗月季根癌病、根腐病的復合砧木品種。

關鍵詞：月季根癌病；根腐病；砧木

中圖分類號：S685.12+4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-

近年來，月季（Rosa hybrida Hort.）的根癌病和根腐病對花卉生產造成了極大的危害。月季根癌病是由根癌土壤桿菌[Rhizobium radiobacter（Bei. et Van Deldan） Prilzam][1]引起的一種土傳根系病害，一旦感染，會擴散至植物全株，導致植株生長遲緩，生長勢減弱，而且目前還沒有辦法防除。月季根腐病于2001年在日本被發現，是由Pythium helicoides Drechsler引起的一種高溫型土傳根系病害[2]，一旦感染，根部褐變，葉片黃化，最終導致植株死亡。在花卉育種領域，抗病育種與高觀賞價值育種同樣被越來越多的科學家所重視；抗性品種的育成，不僅可以減少農藥的使用，在栽培方面還可以節省人力物力，這對于發展可持續性環保型農業具有極大地推動作用。在月季生產中，國外已廣泛應用了嫁接苗，嫁接植株在生物產量、冠幅及抗病害等方面都高于自根繁殖植株；繁殖月季嫁接苗在中國的推廣也必將成為一種趨勢，并且抗病砧木的應用，無論月季接穗品種有無抗病性，都能使其在病害防治方面具有可能。因此，選育抗病砧木品種成為當前月季應用研究的重要課題。篩選對月季根癌病表現出一定抗性的砧木品種雖然有報道[3-5]，但在實際生產應用中，卻未見普及。周林等[6]利用組織培養幼苗接種法對24個切花月季品種進行根癌病鑒定，發現R. hybrida cv. PEKcougel對根癌病表現出極高的抗性，并且抗性能夠遺傳給后代；而R. hybrida cv. Dukat和R. hybrida cv. Golden Emblem為易感品種[7]。在月季根腐病方面，雖然薔薇（R. multiflora Thunb.）品種R. multiflora cv. Matsushima No.3對根腐病具有很強的抗性[8]，但由于枝條細弱，不適合嫁接，而未能推廣。因此，試驗利用R. hybrida cv. PEKcougel對根癌病的抗性與R. multiflora cv. Matsushima No.3對根腐病的抗性，將這2個品種進行正、反雜交，并利用胚挽救技術，得到雜交后代；然后對獲得的雜交后代進行根癌病、根腐病抗性評價，通過無性繁殖及嫁接親和性試驗，篩選抗根癌病、根腐病的后代，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2009年5月， 以R. hybrida cv. PEKcougel為母本，4倍體R. multiflora cv. Matsushima No.3為父本[9]，進行了人工雜交授粉，再利用胚挽救技術成功獲得雜種后代，并利用R. multiflora特異引物SCAK16[10]進行雜種鑒定，最終確認獲得了3株雜交后代，即R. hybrida×multiflora F1 No.1、R. hybrida×multiflora F1 No.5、R. hybrida×multiflora F1 No.6。

1.2 根癌病抗性鑒定

1.2.1 供試菌株 供試菌株為日本國岐阜縣從月季腫瘤分離得到的根癌土壤桿菌R. radiobacter菌株GOU1[6]，原菌活化采用YEB培養基（Bacto牛肉膏5 g/L+Bacto酵母提取物1 g/L+蛋白胨5 g/L+蔗糖5 g/L+MgSO4·7H2O 0.493 g/L，pH 7.2），活化后菌液濃度為1.0×1010個/mL。

1.2.2 接種 接種鑒定法為岐阜大學開發的瓶外浸蘸法。根癌病鑒定的抗病對照品種為R. hybrida cv. PEKcougel，感病對照品種為R. hybrida cv. Dukat。選擇雜交后代從植株根部發出的15～25 cm長新梢，從上部完全展開的幼葉開始，把向下的頭2個節間作為鑒定材料。樣品用洗潔精溶液清洗，再用流水沖洗20 min，然后用70%乙醇滅菌1 min，于超凈工作臺內，先用1% NaClO滅菌20 min（加2～3滴Tween-20），然后用無菌水浸泡沖洗5次。再在超凈工作臺上將節間橫切成厚度為（5 mm±1 mm）的小段，放入濃度為1.0×1010個/mL的菌液內浸染5 min后，置于沒有添加任何激素的MS培養基內，25 ℃、3 000 lx、16 h日常條件下共存培養72 h。然后將節間小段依次浸入濃度為100、200、500 mg/L的Claforan溶液內約1 min，振蕩洗凈，再置于添加了100 mg/L Claforan的MS培養基內繼代培養6周，每周更換相同的培養基。試驗重復3次，每次每個雜種后代月季節間小段接種培養30個以上。

1.2.3 抗病性評價 培養6周后，觀察是否形成愈傷組織，利用Otten紙電泳法[11]分析成活的愈傷組織是否為腫瘤。將需要鑒定的愈傷組織研磨、離心，取上清液點樣于層析濾紙上，以胭脂堿（Nopaline）標準品為對照，10 mg/mL的亞甲基藍作為電泳標記。電泳液為甲酸∶乙酸∶滅菌水=1∶3∶10混合液。電泳結束后，將層析濾紙干燥，噴染色液（Phenanthrenequinone 10 mg+99%乙醇50 mL∶NaOH 5 g+60%乙醇50 mL=1∶1），再次干燥，然后用紫外燈檢測儀觀察是否出現熒光斑點，判斷是否為腫瘤。

愈傷組織形成率=形成愈傷組織的成活節間莖段/成活節間莖段總數×100%。

腫瘤形成率=形成腫瘤的成活節間莖段/成活節間莖段總數×100%。

1.3 根腐病抗性鑒定

1.3.1 供試菌株 供試菌株為岐阜縣從微型月季根部分離得到的高溫型土傳P. helicoides菌株B5[2]。接種源為利用Glassblade法[12]形成的游走子，再利用血球計數板將游走子密度調整為1.0×103個/L。

1.3.2 接種 接種鑒定法參照文獻[8]的方法，根腐病鑒定的抗病對照品種為4倍體R. multiflora cv. Matsushima No.3，感病對照品種為R. hybrida cv. Nakashima 91。分別取雜交后代從植株根部發出的70～100 cm長的新枝條，剪成含一個芽點的3～5 cm長的插穗，基部輕蘸0.5%吲哚丁酸（IBA）粉劑，扦插于含草炭的混合培養土與蛭石為2∶1的基質中。將生根的插穗進行接種，1周后調查根部褐變度，褐變指數按以下7個級別實施調查，①0.0，健全的白根；②0.5，輕微褐變；③1.0，少部分褐變；④ 1.5，全體50%褐變；⑤2.0，全體75%褐變；⑥2.5，地上部存活，根部褐變；⑦3.0，地上部枯死，根部褐變。再按下列計算公式算出褐變度。試驗重復3次，每次每個品種鑒定30個插穗以上。

褐變度=Σ（褐變指數×褐變株數）/（最大褐變指數×調查株數）×100%。

1.4 扦插成活試驗

對照砧木品種為香水月季[R. odorata（Andr.）Sweet.]及4倍體薔薇品種R. multiflora cv. Matsushima No.3。剪取新發的成熟枝條，去掉下部較粗部分和上部未成熟部分，每個插穗留一個芽眼，輕蘸0.5% IBA，利用穴盤進行扦插，扦插基質為2∶1含草炭的混合培養土與蛭石。扦插環境為溫度（23 ℃±2 ℃）、濕度90%以上、光照度4 000 lx的全光照自動噴霧育苗室。扦插生根培養一個月后，調查生根率。5個品種（單株）都重復3次，每次50株以上。

扦插成活率=生根插穗數/插穗總數×100%。

1.5 嫁接親和性試驗

對照砧木為香水月季，處理砧木是3個雜種后代，接穗品種是R. hybrida cv. Samurai 08，嫁接法為貼接，用夾子夾住。嫁接2個月后調查了嫁接成活率。每個嫁接組合一次性嫁接100株。

嫁接成活率=成活植株數/嫁接株數×100%。

2 結果與分析

2.1 月季根癌病鑒定

繼代培養6周后，統計了存活莖段的愈傷組織形成率，結果見圖1。從圖1可見，R. hybrida×multiflora F1 No.1、R. hybrida×multiflora F1 No.5、R. hybrida×multiflora F1 No.6的愈傷組織形成率分別為28.8%、27.3%、20.5%，顯著低于R. hybrida cv. Dukat的91.2%（P<0.05），與12.5%的R. hybrida cv. PEKcougel無顯著差異（P>0.05）。在內源激素的作用下，即使根癌病菌侵染未成功，莖段也會形成愈傷組織，腫瘤與愈傷組織用肉眼無法判別；因此又對存活莖段形成的愈傷組織是否為腫瘤進行了鑒定，其腫瘤形成率見圖2。從圖2可見，R. hybrida cv. PEKcougel的腫瘤形成率為0，R. hybrida×multiflora F1 No.1、R. hybrida×multiflora F1 No.5、R. hybrida×multiflora F1 No.6的腫瘤形成率分別為22.4%、26.4%、20.5%，顯著低于77.2%的R. hybrida cv. Dukat（P<0.05）。

2.2 月季根腐病鑒定

供試植株接種一周后，插穗褐變度情況見圖3。圖3所示，感病品種R. hybrida cv. Nakashima 91的褐變度為55.5%，抗性品種R. multiflora cv. Matsushima No.3的褐變度為8.8%。R. hybrida×multiflora F1 No.1、R. hybrida×multiflora F1 No.5的褐變度分別為24.1%，25.8%，都顯著低于感病品種R. hybrida cv. Nakashima 91（P<0.05），R. hybrida×multiflora F1 No.6的褐變度為12.9%，顯著低于R. hybrida cv. Nakashima 91及R. hybrida×multiflora F1 No.1、R. hybrida× multiflora F1 No.5（P<0.05），與抗病品種R. multiflora cv. Matsushima No.3無顯著差異（P>0.05）。

2.3 月季扦插成活率

扦插易成活是作為砧木的重要指標之一，試驗的扦插成活率情況見圖4。從圖4可見，對照砧木香水月季和薔薇R. multiflora cv. Matsushima No.3都達到了100%，而R. hybrida×multiflora F1 No.1、R. hybrida×multiflora F1 No.5、R. hybrida×multiflora F1 No.6的扦插成活率分別為73.6%，68.5%，71.8%，3株雜交后代間無顯著差異（P>0.05），但與2個砧木品種的成活率達到了顯著差異水平（P<0.05）。

2.4 月季嫁接親和性

作為砧木品種，嫁接親和性是一個很重要的指標，試驗達到的嫁接成活情況見圖5。從圖5可見，砧木品種香水月季與接穗品種R. hybrida cv. Samurai 08嫁接后的成活率為100%，雜交后代R. hybrida×multiflora F1 No.1、R. hybrida×multiflora F1 No.6作為砧木與接穗的嫁接成活率也達到了100%，但R. hybrida×multiflora F1 No.5的嫁接成活率卻為80%，低于香水月季及R. hybrida×multiflora F1 No.1、R. hybrida×multiflora F1 No.6的水平。

3 小結與討論

采用日本岐阜大學開發的月季根癌病鑒定的瓶外浸蘸法，測試得到的根癌病抗性品種R. hybrida cv. PEKcougel、感病品種R. hybrida cv. Dukat的腫瘤形成率分別為0、77%，與In vitro法鑒定得到的發病率情況基本一致[4，6]，表明瓶外浸蘸法鑒定根癌病具有實用性。Zhou等[13]報道，鑒定月季根癌病的In vitro法，首先需要將試驗材料進行組織培養，達到能夠進行根癌病鑒定的要求后才能實施，其操作費時、費工。而新開發的瓶外浸蘸法，可以直接使用植株新梢，操作簡便、可行，如果要進行大批量實驗材料的鑒定時，可以在很大程度上節省時間與人力。但此方法使用的新梢容易受栽培環境、施肥時期、修剪方式等因素的影響，所以要求將鑒定植株在相同條件下栽植管理。本試驗所采枝條的月季均定植在相同的栽培條件下，保證了試驗材料栽培管理的一致性。

試驗在侵染莖段培養過程中，出現了褐變枯死的莖段，而且還發現了有已形成愈傷組織而枯死的莖段，未形成愈傷組織褐變枯死莖段的枯死時期與病菌感染成功時間的前后無法判定；此外，植物外植體離體培養時，條件適宜可形成愈傷組織[14]，分析試驗里形成愈傷組織的枯死莖段可能是受根癌病菌感染后形成的腫瘤，也可能是未感染、單純形成的愈傷組織，所以，以上2種情況的褐變枯死莖段的腫瘤形成率無法判斷。由于試驗只使用了生存的莖段統計腫瘤形成率，根癌病抗性品種R. hybrida cv. PEKcougel、感病品種R. hybrida cv. Dukat的腫瘤形成率與前人結果[4，6]對比基本一致，表明了數據統計的可行性。5個試驗材料間雖然愈傷組織形成率與腫瘤形成率的趨勢基本一致，但經鑒定，形成的愈傷組織并不一定就是腫瘤，所以建議對形成的愈傷組織進行腫瘤鑒定，以腫瘤形成率為判定結果。

3株雜種后代根腐病褐變度都為20%左右，對根腐病都具有較強的抗性，進一步表明抗根腐病品種R. multiflora cv. Matsushima No.3的抗性是可遺傳的，這與文獻的研究結果[15]是一致的。目前，雖然日本以外的國家沒有月季根腐病發病的報道，但由于月季在國際市場上日益頻繁的流通，增加了各種病害隨之傳播到世界各地的可能性。同時，月季嫁接苗的使用也必將是月季產業的發展趨勢，所以，抗月季根腐病砧木品種的育成具有重要的意義。

試驗里雜交后代的扦插生根率為70%左右，雖然未達到常用砧木品種100%的成活率，但據日本月季生產者說也是充分達到了砧木品種的要求。并且扦插生根率受環境條件及枝條狀態影響較大，其扦插成活率有進一步提高的可能。

嫁接親和性試驗的嫁接法是在日本普遍應用的將砧木與接穗的接合部分用夾子夾住的方法，接穗R. hybrida cv. Samurai 08是日本紅色月季的主栽品種。雖然R. hybrida×multiflora F1 No.5的嫁接成活率為80%，但整體來看，雜種后代具有較高的嫁接親和性。另外，試驗還對不同嫁接組合的愈合情況做了石蠟切片觀察（數據未使用），其接口均愈合良好，沒有發現不良現象。

試驗結果表明，3株雜交后代均具有較強發枝力及枝條伸長性，其中R. hybrida×multiflora F1 No.1、R. hybrida×multiflora F1 No.6的刺密度較R. hybrida×multiflora F1 No.5少，與香水月季同等程度。綜合考慮后認為，R. hybrida×multiflora F1 No.1更有望成為抗根癌病、根腐病的復合砧木品種。

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