冬凌草生物學研究進展

摘要：冬凌草（Rabdosia rubescens）是唇形科香茶菜屬一種抗腫瘤藥用植物，二萜類主要成分冬凌草甲素是其主要的活性物質。對冬凌草的生物學特性、分布、遺傳多樣性、冬凌草甲素及其抗癌活性、冬凌草甲素生物合成路徑及其二萜類合酶、冬凌草的轉錄組等研究方面進行了綜述，為冬凌草種質資源的合理開發利用及其相關的生物分子機制進一步發現奠定基礎。

關鍵詞：冬凌草（Rabdosia rubescens）；遺傳多樣性；生物合成路徑；轉錄組

中圖分類號：R282.71 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）19-4901-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.19.002

Abstract： Rabdosia rubescens is an antitumor medicinal plant in Labiatae family. Diterpenes，especially oridonin，were the main active components in this plant. The biological characteristics，distribution，genetic diversity，oridonin and its antitumor activity，biosynthesis pathways of oridonin and its diterpenes synthase，and transcriptome of R. rubescens were summarized，to provide scientific reference for the rational exploitation and utilization of germplasm resource of R. rubescens and further discovery of the relative bio-molecular mechanisms.

Key words： Rabdosia rubescens； genetic diversity； biosynthesis pathways； transcriptome

冬凌草，學名碎米椏[Rabdosia rubescens（Hemsl.） Hara.]，拉丁文學名由原來的[Isodon rubescens（Hemsl.） Hara]修訂為[Rabdosia rubescens（Hemsl.） Hara.）][1]，唇形科香茶菜屬多年生草本或亞灌木植物的干燥地上部分，是一種重要的藥用植物，主要分布于黃河、長江流域，主產于河南濟源太行山一帶[2]。冬凌草全草入藥，藥苦、甘，性微寒；具有清熱解毒、活血止痛、抗菌消炎[3]等功效，其粗制劑具有抗癌作用[4]。冬凌草中含有萜類、黃酮類、生物堿、甾體、揮發油、氨基酸、有機酸、單糖等成分[5]，其中對映-貝殼杉烷類二萜化合物，特別是冬凌草甲素是冬凌草中含量最高、生物活性較強、藥用價值和經濟價值豐富的一類有效成分[6]。冬凌草由于被肆意采挖造成了資源瀕于枯竭、品種退化、活性成分減少等問題。目前，對冬凌草的研究更多地集中在化學成分及其藥理作用方面，而對冬凌草遺傳多樣性及其代謝路徑等方面還有待進一步研究。本文就其生物學特性、資源分布、遺傳多樣性、冬凌草甲素及其抗癌機制、冬凌草甲素生物合成路徑及其二萜類合酶、冬凌草的轉錄組研究方面進行了綜述，旨在為有效運用生物學研究方法來改善冬凌草人工栽培中存在的問題，改善其代謝途徑以及提高其活性成分奠定基礎。

1 冬凌草的生物學特性

冬凌草為亞灌木植物，高0.3～1.2 m，木質根莖，有長纖維狀須根。莖直立，多數，基部近圓柱形，無毛，皮層縱向剝落，上部多分枝，分枝具花序，莖上部及分枝均四棱形，具條紋，帶紫紅色。莖葉對生，聚傘花序3～5花，最下部者有時多至7花。花盤環狀，小堅果倒卵狀三棱形，淡褐色，無毛。花期7～10月，果期8～11月[7]。冬凌草染色體數目為2n=2x=24[8]。冬凌草種子均為倒卵形，但不同發育程度冬凌草種子在形態特征上明顯不同，從種皮顏色上可以將其分為褐色具花紋和褐色種子兩大類。董誠明等[9]研究發現種子蛋白表達量的差異導致兩種不同的發育類型。冬凌草的表皮細胞的形狀、氣孔類型均相同，但其葉基形狀、葉長、葉寬、葉表皮微形態特征存在明顯的差異[10]。隨著冬凌草日常需求量的增加，冬凌草的栽培技術得到了很大的改進，從種子繁殖、幼苗扦插、移植栽培、病蟲防治等方面提高種苗的產量[11-13]。通過組織培養技術建立冬凌草無性快繁體系是促進冬凌草大面積人工栽培， 緩解自然資源匱乏現狀的有效途徑[14，15]。

2 冬凌草的地理分布

唇形科香茶菜屬[Rabdosia （Bl.） Hassk]植物全世界約有150種，在非洲南部、南亞、東南亞以及東歐等地區都有分布。中國有90 個種和21個變種，在湖北、四川、貴州、廣西、陜西、甘肅、山西、河南、河北、浙江、安徽、江西及湖南等省區均有分布，主要分布在長江以南以及西南各省區。冬凌草屬于廣布種，在湖北、四川、貴州、廣西、陜西、甘肅、山西、河南、河北、浙江、安徽、江西及湖南等省區均有分布。主要集中分布于太行山區，藥用冬凌草也主要產于這一地區。王新民等[16]采用中藥材產地適宜性分析地理信息系統（TCMGIS）分析得出冬凌草全國適宜區分布（圖1）。冬凌草的分布很廣，而隨著各地對其需求量的增加，野生的冬凌草資源瀕臨枯竭，因此通過對不同地區的自然居群進行遺傳多樣性分析，并收集代表性的種質資源，建立冬凌草核心種質庫，篩選優良的種質資源才能實現冬凌草的大面積人工種植。

3 冬凌草遺傳多樣性研究

研究遺傳多樣性的方法包括形態宏觀水平的性狀統計和分子微觀水平的同工酶、等位酶以及DNA分子標記方法，例如RFLP、RAPD、SSR、ISSR、AFLP和DNA測序等。DNA分子標記方法的研究對象是遺傳物質本身，不受物種所處環境條件和發育階段的影響，又能反映環境條件對物種遺傳選擇的影響，成為研究物種遺傳多樣性和品種鑒定的主要方法。表1中總結了目前冬凌草及其相關香茶菜屬的遺傳多樣性的研究概況。除了上述分子標記方法外，現在又發展了許多現代分子標記技術，郭培國等[17]運用微衛星錨定片段長度多態性（Microsatellite-anchored fragment length polymorphism，MFLP）利用擴增片段長度多態性（AFLP）和SSR錨錠引物技術的雙重原理建立的一種分子標記技術對菜薹種質遺傳多樣性進行了分析。而冬凌草的遺傳多樣性分析還停留在初始階段。

李國民等[22]從遺傳距離上對不同地區、各種類型的冬凌草進行了基因水平的分類，研究表明產地差異和類型差異共同影響了冬凌草種質資源的多樣性和復雜性，冬凌草在物種水平上具有較高的遺傳多樣性，居群水平遺傳多樣性較低，大部分遺傳變異存在于居群間，與其他研究類似[25]。而魏俊杰[26]在研究河南濟源地區的兩種冬凌草（一類是含有冬凌草甲素的冬凌草，另一類是含OGP-46的冬凌草）時，從內環境因素中的內生菌及遺傳因素中的rDNA ITS序列兩方面探討形成這種差異的可能原因，但2種類型的冬凌草在ITS序列上并未表現出顯著的差異。說明居群內擁有較低的居群特有多態位點，但這些位點是否與次生代謝產物合成基因相關，是否可以作為分子鑒定的依據，還有待進一步研究。

冬凌草的種質資源多種多樣，不同地區冬凌草二萜類成分明顯不同，而不同變異類型冬凌草二萜類成分也發生變化，無明顯規律性。植株的生長受到各種因素的影響，光、溫度、濕度、土壤肥沃程度、海拔、氣候條件等都能明顯地影響冬凌草的生長及其次生代謝產物的合成。隨著產地生態環境的不同，其次生代謝成分的結構類型會有較大的變化，這種次生代謝成分上的多樣性是常見的生物多樣性現象的表現之一。在貴州產冬凌草中就沒有發現冬凌草甲素和乙素的存在，而在河南產的冬凌草中就主要含有冬凌草甲素[27]。陳隨清等[28]通過冬凌草指紋圖譜對來自不同產地和不同類型的冬凌草進行分析發現不同地區冬凌草二萜類成分明顯不同。不同地區冬凌草二萜類成分不同，而且同一地區的同一株冬凌草不同部位的二萜類成分也有較大的差異。廖偉玲等[29]采用薄層色譜法對冬凌草中齊墩果酸和冬凌草甲素進行定性鑒別，高效液相色譜法測定冬凌草甲素含量，發現不同地方分布、冬凌草不同部位冬凌草甲素含量都有較大的差別。說明冬凌草隨著產地生態環境（海拔、水、土和氣候條件等）的不同，其次生代謝成分的結構類型會有較大的變化。僅從化學成分差異去分析冬凌草的種質資源的分布規律和差異是遠遠不夠的，尤其是在DNA分子標記發展迅速的情況下，可以深入到遺傳分子層面去分析其遺傳差異，并運用基因工程技術對其進行改造。如通過組織培養對優良的冬凌草進行人工栽培，能有效解決野生冬凌草的匱乏問題；研究冬凌草內二萜類主要成分冬凌草甲素的生物合成路徑并克隆相關酶的基因，通過轉基因技術改造出能合成更多冬凌草甲素的冬凌草。

4 冬凌草甲素及其抗癌活性

冬凌草甲素（Oridonin）屬7，20-環氧型對映-貝殼杉烷類二萜化合物，為無色針狀結晶，味道極苦，微溶于水，可溶于甲醇、乙酸乙酯、丙酮等有機溶劑。冬凌草甲素有很高的抗癌活性，其抗癌活性是由于分子中α-亞甲基環戊酮部分結構，裂環或亞甲基飽和則作用消失[30，31]。冬凌草甲素分子式為C20H28O6，相對分子質量為364.43，熔點為248～250 ℃，分子結構見圖2。

冬凌草甲素顯著抑制人肺癌細胞系A549和PC-9細胞的體外增殖、黏附和侵襲，將細胞周期阻滯在G2/M期，促進E-cadherin的表達，下調CDK1、β-catenin等抗體的表達和NF-κB轉錄活性[33]。冬凌草甲素通過與受體結合或抑制腫瘤細胞的鈉泵轉運活性，從而抑制腫瘤細胞從周圍環境中攝取營養物質，延緩腫瘤細胞的生長速度，使瘤體縮小甚至消失。冬凌草甲素還有抑制急性淋巴細胞白血病細胞系（CEM）的作用，通過破壞CEM的細胞膜和誘導其細胞凋亡，上調和下調與細胞凋亡相關的蛋白以發揮抗白血病作用[34]。冬凌草甲素目前在治療腫瘤方面有很重要的作用，因此研究冬凌草甲素的生物合成路徑及其相關基因的克隆，通過轉基因技術改造其生物合成，以期得到含有大量冬凌草甲素的冬凌草是冬凌草研究的一個重要方向。

5 冬凌草甲素生物合成路徑、二萜類合酶及其相關基因的克隆

冬凌草甲素通過甲羥戊酸途徑（Mevalonic acid，MVA）和脫氧木酮糖-5-磷酸途徑（Methyl-D-erythritol phosphate，MEP）形成異戊烯基焦磷酸（Isopentenyl pyrophosphate，IPP），以形成的IPP為前體物質形成牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（Geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP），再以GGPP為底物在二萜合酶的催化作用下形成二萜骨架或終產物（即貝殼杉烯化合物），然后通過細胞色素P450修飾底物結構[35]生成冬凌草甲素。圖3為冬凌草甲素的生物合成路徑[36，37]。

合成冬凌草甲素相關的酶有MVA途徑的硫解酶、羥甲基戊二酰輔酶A合酶（HMGS）、羥甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）、甲羥戊酸激酶（MK）、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶（MVAPP）；MEP途徑的脫氧木酮糖-5-磷酸合酶、脫氧木酮糖磷酸鹽還原異構酶（DXP synthase）、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚醇合酶、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤蘚糖激酶、2-甲基赤蘚糖-2，4-環二磷酸合酶、1-羥基-2-甲基-2-（E）-丁烯基-4-二磷酸合酶、異戊烯基單磷酸激酶；通過MVA途徑和MEP途徑形成IPP，再由IPP通過一系列的反應合成貝殼杉烯化合物，這一過程需要的生物合酶有牻牛兒基焦磷酸合成酶（Geranyl pyrophosphate synthase，GPS）、法呢基焦磷酸合成酶（Farnesyl diphosphate synthase，FDS）、牻牛兒牻牛兒基焦磷酸合成酶（Geranyl geranyl pyrophosphate synthase，GPS）、柯巴基焦磷酸合酶（Copalyl diphosphate synthase，CDS）、貝殼杉烯合酶（Kaurene synthase，KS）等，最后通過細胞色素P450修飾底物結構生成最終的冬凌草甲素。雖然人們知道了冬凌草甲素的生物合成路徑，但是目前未見到以冬凌草為材料研究合成冬凌草甲素的酶及其相關基因克隆的報道，上述基因在其他植物或微生物中已經被克隆出來，表2是目前對合成冬凌草甲素部分合酶及其相關基因在不同植物中的克隆情況。GenBank中并沒有發現冬凌草中合成冬凌草甲素相關的酶基因，這無疑給冬凌草甲素的生物合成路徑研究帶來困難，在目前生物信息學等交叉學科的迅速發展下，冬凌草甲素的生物合成路徑中酶基因的研究肯定會得到突破。

6 冬凌草的轉錄組研究

冬凌草轉錄組方面的研究很少，截至到2015年11月13日NCBI登錄的冬凌草的基因序列只有61條。隨著生物理論的發展，衍生出了很多的生物學研究方法，系統發生學、種群遺傳學還有條形碼的分類等，更進一步深化生物學的研究。夏至等[41]通過分子鑒定和親緣關系研究的方法得出5條葉綠體基因序列、5條ITS片段序列。Yu等[42]通過研究唇形科香茶菜屬的系統發生關系和生物地理學得到3條葉綠體基因序列、1條花序基因、1條ITS。Harris等[43]運用一種結合系統發生學和種群遺傳學的方法研究得出對應的序列28條，微衛星標記得到微衛星序列11條[21]。陜西省微生物研究所的Li等上傳18S基因3條。陳士林等上傳葉綠體基因序列2條，1條ITS序列。2015年4月，來自河南大學的Zhu上傳了冬凌草中1條乙酰輔酶a-C-乙酰轉移酶基因完整序列，長度為1 254 bp，這也是目前已知的惟一冬凌草生物合酶基因。

二萜類作為冬凌草最主要的抗癌成分，特別是二萜類的冬凌草甲素，它們的生物合成途徑倍受重視。二萜類的生物合成路徑有很多種，二萜化合物生物合成途徑中的相關酶，特別是二萜合酶成為近年來研究的熱點，當然二萜合酶相關基因在其他植物中研究有許多，在冬凌草中的研究目前還沒有。加拿大學者對包括冬凌草在內的低等到高等共10個含有二萜類化合物的植物進行454、Illumina轉錄組測序后進行二萜代謝路徑中二萜合成酶和P450家族基因挖掘。在近1百萬個萜類合成相關的轉錄本中發現了46個新的二萜合成酶和400個相關的P450基因[44]。冬凌草葉子的454、Illumina GA II、Illumina Hiseq2000這3個轉錄組的數據登錄在NCBI，但是基因序列并沒有注釋。隨著生物研究方法的不斷豐富，如生物信息學的發展，冬凌草的研究除了以系統發生分類學和遺傳多樣性方面，還可以更深入地進行轉錄組序列分析，為冬凌草生物合成路徑的研究奠定基礎。

7 前景與展望

冬凌草作為天然藥物在臨床上的應用非常廣泛，具有清熱解毒、活血止痛之功效，現代研究證明還有抗腫瘤作用，具有很高的藥用價值。對冬凌草的生物學特性、主要化學成分到分子生物學階段的研究，無疑還存在許多方面的不足。通過對冬凌草遺傳多樣性和種質資源的研究，可以篩選出優良的種質資源，以便人工栽培。

目前研究最多的化學成分是冬凌草的二萜類，而來源于冬凌草中的二萜類往往含量低，且天然冬凌草資源有限，因此關于二萜類在生物體內的合成路徑越來越受到人們的關注。冬凌草中的二萜類屬于對映-貝殼杉烷類二萜化合物，其相對應的生物合成途徑過程長而復雜，至今對于冬凌草二萜類合成路徑的研究處于初級階段。研究二萜類的合成相關基因和闡明其代謝途徑將成為冬凌草也是大多數藥用植物現代化研究的發展趨勢之一。隨著對冬凌草研究的不斷深入，借助于代謝調控等生物工程手段，實現藥用成分的人工介入生物生產是未來的發展方向之一。

參考文獻：

[1] 中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志[M].北京：科學出版社，1977.

[2] 李靜一.野生冬凌草資源分布調查、開發與保護[J].河南林業科技，2004，24（3）：48-50.

[3] 戴 一，賈曉益，宋祖榮，等.冬凌草抗炎有效部位篩選及初步表征[J].中國醫院藥學雜志，2015，35（6）：495-498.

[4] IKEZOE T，CHEN S S，TONG X J，et al. Oridonin induces growth inhibition and apoptosis of a variety of human cancer cells[J]. International Journal of Oncology，2003，23（4）：1187-1193.

[5] 郭 琳，程永現，白 明，等.冬凌草現代研究分析[J].中醫學報，2015，30（3）：412-414.

[6] BAI N，HE K，ZHOU Z，et al. Ent-Kaurane diterpenoids from Rabdosia rubescens and their cytotoxic effects on human cancer cell lines[J].Planta Med，2010，76（2）：140-145.

[7] 陳隨清，董成明，馮衛生.太行山區冬凌草生態環境及生物學特性研究[J].中國野生植物資源，2005，24（4）：33-35.

[8] 趙侯明，宋發軍，覃 瑞.冬凌草的染色體數目及核型分析[J].中南民族大學學報（自然科學版），2007，26（4）：35-37.

[9] 董誠明，蘇秀紅，李增光，等.兩種冬凌草種子的生物學特性及蛋白質電泳的比較研究[J].河南科學，2008，26（1）：39-41.

[10] 蘇秀紅，董誠明，馮衛生，等.冬凌草葉片形態多樣性的研究[J].時珍國醫國藥，2007，18（10）：2351-2353.

[11] 張建鵬，尚霄麗，付向凌.冬凌草及其高效栽培管理技術[J].現代園藝，2013（10）：26-28.

[12] 吳小勇.冬凌草無公害人工繁殖栽培技術[J].種子科技，2010（4）：36-38.

[13] 賈永貴.野生冬凌草無公害栽培技術[J].現代農業科技，2009（4）：33-34.

[14] 魏景芳，李冬杰，張進獻.冬凌草的組織培養與快速繁殖[J].安徽農業科學，2005，33（7）：1227-1227.

[15] 徐莉莉，聶世現，黃文靜，等.冬凌草組織培養及其愈傷組織誘導研究[J].生物學雜志，2010，27（3）：24-26.

[16] 王新民，謝彩香，陳士林，等.冬凌草適宜產區區劃研究[J].安徽農業科學，2008，36（31）：13677-13680.

[17] 郭培國，許蘭桂，夏巖石，等.菜薹種質遺傳多樣性的熒光MFLP標記分析[J].園藝學報，2015，42（2）：350-360.

[18] PASSINHO-SOARES H，FELIX D，KAPLAN M A，et al. Authentication of medicinal plant botanical identity by amplified fragmented length polymorphism dominant DNA marker：Inferences from the Plectranthus genus[J].Planta Med，2006，72（10）：929-931.

[19] 盧小蕾，陳隨清，李雪菊，等.河南產香茶菜屬6種植物的RAPD分析[J].河南科學，2006，24（6）：841-843.

[20] TADASHI Y，ASUKA Y，IKUMI D，et al. Development of microsatellite markers for Isodon longitubus（LAMIACEAE）[J].Applications in Plant Sciences，2013，1（10）：doi：10.3732/apps.1300028.

[21] HARRIS E S，KLOOSTER M R. Development of microsatellite markers for the medicinal plant Isodon rubescens（Lamiaceae） and related species[J].American Journal of Botany，2011，98（10）：e293-e295.

[22] 李國民，李忠超，許凱楊，等.抗癌植物冬凌草種質資源遺傳多樣性分析[J].熱帶亞熱帶植物學報，2008，16（2）：116-122.

[23] 婁玉霞，董誠明，喬毅琳.不同產地冬凌草生態特征比較[J].中醫學報，2013，28（10）：1506-1507.

[24] 崔 璨.冬凌草種質資源研究[D].鄭州：河南中醫學院，2010.

[25] 羅 凱，盧會翔，吳正丹，等.中國西南地區甘薯主要育種親本的遺傳多樣性及群體結構分析[J].中國農業科學，2016，49（3）：593-608.

[26] 魏俊杰.冬凌草化學型形成機理的初步研究[D].鄭州：鄭州大學，2012.

[27] 韓全斌，趙勤實，黎勝紅，等.貴州冬凌草中的對映-貝殼杉烷二萜化合物[J].化學學報，2003，61（7）：1077-1082.

[28] 陳隨清，崔 璨，裴莉昕，等.不同產地和來源冬凌草藥材的質量評價[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（17）：122-126.

[29] 廖偉玲，杜 卓，張 婷，等.不同產地冬凌草定性定量質量評價[J].中南藥學，2010，8（12）：912-915.

[30] OWONA B A，SCHLUESENER H J. Molecular insight in the multifunctional effects of oridonin[J].Drugs R D，2015，15（3）：233-244.

[31] 楊延武，許肖龍，王德華，等.抗癌藥物冬凌草甲素的分子構型研究[J].化學學報，1992，50（5）：498-503.

[32] 冉 倩，徐進宜，吳曉明，等.冬凌草甲素的研究進展[J].藥學與臨床研究，2007，15（2）：91-95.

[33] 王 健，周 雯，宋秀宇，等.冬凌草甲素對人肺癌A549和PC-9細胞侵襲的抑制作用和機制研究[J].天津醫藥，2015，43（9）：965-969.

[34] 郭 勇，單卿卿，龔玉萍，等.冬凌草甲素抗T細胞急性淋巴細胞白血病效應的實驗研究[J].四川大學學報（醫學版），2014， 45（6）：903-907.

[35] 汪建峰，蒙海林，王 勇.萜類合成生物學研究進展[J].中國科學：生命科學，2015，45（10）：1040-1050.

[36] 陸錦池，陳榮山，劉長輝，等.淺述植物萜類物質的生物合成途徑[J].農業科技通訊，2009（3）：78-80.

[37] 何云飛，高 偉，劉塔斯，等.二萜合酶的研究進展[J].藥學學報，2011，46（9）：1019-1025.

[38] CHEN X，L？譈 S，ZHANG Y.Characterization of protein phosphatase 5 from three lepidopteran insects：Helicoverpa armigera，Mythimna separata and Plutella xylostella[J].PLoS ONE，2014， 9（5）：e97437.

[39] ZERBE P，CHIANG A，DULLAT H，et al. Diterpene synthases of the biosynthetic system of medicinally active diterpenoids in Marrubium vulgare[J].Plant J，2014，79（6）：914-927.

[40] MOTAMAYOR J C，MOCKAITIS K，SCHMUTZ J，et al.The genome sequence of the most widely cultivated cacao type and its use to identify candidate genes regulating pod color[J].Genome Biol，2013，14（6）：53-58.

[41] 夏 至，張紅瑞，李賀敏，等.碎米椏及其近緣種的分子鑒定和親緣關系研究[J].中草藥，2013，44（20）：2904-2909.

[42] YU X Q，MAKI M，DREW B T，et al. Phylogeny and historical biogeography of Isodon（Lamiaceae）：Rapid radiation in south-west China and Miocene overland dispersal into Africa[J].Mol Phylogenet Evol，2014，77：183-194.

[43] HARRIS E S，CAO S，SCHOVILLE S D，et al. Selection for high oridonin yield in the Chinese medicinal plant Isodon（Lamiaceae） using a combined phylogenetics and population genetics approach[J].PLoS ONE，2012，7（11）：e50753.

[44] PHILIPP Z，BJ？魻RN H，MACAIRE M S，et al. Gene discovery of modular diterpene metabolism in nonmodel systems[J].Plant Physiology，2013，162（2）：1073-1091.