不結球白菜BcGAPDH的生物信息學分析

摘要：采用生物信息學方法對克隆測序的不結球白菜（Brassica campestris ssp. chinensis）BcGAPDH （3-磷酸甘油醛脫氫酶）蛋白質的理化性質、跨膜區、親水性、亞細胞定位、所含模體及蛋白質結構進行了預測。理化性質分析表明，該酶含有328個氨基酸，相對分子量為35 161.2，pI值為9.03。TMpred跨膜分析表明，該酶沒有跨膜螺旋區，這與ProtScale預測的該酶為親水性蛋白質相吻合。用Target P server程序預測該酶定位于線粒體上，結構域分析表明該酶含有多種磷酸化位點，二級結構以α-螺旋和隨機卷曲為主。借助SWISS-MODEL軟件對該酶進行了三維同源建模。

關鍵詞：不結球白菜（Brassica campestris ssp. chinensis）；BcGAPDH；生物信息學

中圖分類號：S634.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）11-2917-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.11.053

三磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一直被作為糖酵解過程的重要角色來研究，在糖酵解和糖異生過程中是關鍵酶，參與糖酵解過程中第一個ATP的形成[1]，使3-磷酸甘油醛轉變為1，3-二磷酸甘油醛。該酶在生物體中高效表達，且通常作為一種模式蛋白質用于蛋白質和酶的分析，也可以用作研究基因表達量的內在對照。

作為一個含量豐富的胞內蛋白質，GAPDH成為一個實用模型，用于研究酶作用機制以及氨基酸序列與蛋白質結構的相互關系。隨著分子技術的發展，被認定為“看家基因”的GAPDH又提供了一個基因分析的模型，用于研究細胞組成和遺傳信息的表達。經過一系列的研究，特別是近10年的快速進展，已經表明GAPDH不是一個純粹簡單的糖酵解蛋白質，它還具有以下生理功能[2-8]：①膜融合，抑制GAPDH活性后能明顯抑制有絲分裂后期的核膜組裝，而再加入有活性的GAPDH后，核膜組裝修復；②囊泡運輸，參與囊泡轉運，且與其糖酵解功能無關；③蛋白磷酸轉移酶的分子伴侶，為轉移抑制基因nm23-H1的特異分子伴侶；④DNA修復，GAPDH的37 KDa亞基與胎盤提取的尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）具有同樣的DNA修復活性；⑤其他功能，具有轉錄調節活性，調節RNA的核輸出，介導微管的相互作用，轉鐵蛋白質的活性等。

目前，許多植物的GAPDH基因均已被克隆，但是關于其酶蛋白分子的結構和功能的進一步研究鮮見報道。本試驗采用生物信息學方法對已克隆測序的不結球白菜（Brassica campestris ssp. chinensis）BcGAPDH（3-磷酸甘油醛脫氫酶）蛋白質的理化性質、跨膜區、親水性、亞細胞定位、所含模體及蛋白質結構進行了預測，為進一步研究該蛋白質提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

以南京農業大學園藝學院白菜課題組克隆測序的不結球白菜3-磷酸甘油醛脫氫酶（BcGAPDH）基因相關數據為研究對象，其DDBJ登錄號為AB331373。

1.2 方法

利用ProtParam分析蛋白質的理化性質[9]；利用TMpred、PHDhtm和ANTHEPROT軟件分析蛋白質的跨膜區域[10]；利用ProtScale分析蛋白質的親水性[9]；采用SignalP v3.0進行信號肽分析[10]；分別利用Target P server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）、Subloc V server（http：//www.bioinfo.tsinghua. ed.cn/SubLoc/eu-predict.htm）和WOLFPSORT server（http：//psort.nibb.ac.jp）預測蛋白質的亞細胞定位情況；利用在線軟件ScanProsite（http：//www.expasy.org/cgi-bin/prosite/ScanView）分析蛋白質所含模體；蛋白質二級結構預測和三維建模分別使用在線軟件SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）和SWISS-MODEL完成[11]。

2 結果與分析

2.1 不結球白菜BcGAPDH蛋白質理化性質分析

對不結球白菜BcGAPDH氨基酸序列的理化性質進行分析，結果表明，該酶含有328個氨基酸，總相對分子量為35 161.2，理論等電點pI值為9.03，負電荷氨基酸（Asp+Glu） 37個，正電荷氨基酸（Arg+Lys）36個，分子式C1558H2507N433O473S9，原子總數

4 980，摩爾消光系數1.043（胱氨酸全按半胱氨酸計），該酶蛋白不穩定性參數為20.46，屬于穩定蛋白，其脂肪系數為99.54，平均親水性（GRAVY）為0.006，預測該蛋白質為水溶性蛋白質。

2.2 不結球白菜BcGAPDH蛋白質跨膜結構域及疏水性的預測和分析

用TMpred在線軟件對不結球白菜BcGAPDH氨基酸序列的跨膜結構域進行預測，結果（圖1）表明，不結球白菜BcGAPDH整條肽鏈都位于細胞膜外，說明其不存在跨膜區。此外，利用在線軟件PHDhtm和ANTHEPROT對該酶跨膜螺旋進行預測，結果與TMpred所預測的結果一致，即均沒有跨膜螺旋。因此，此被預測的跨膜螺旋區可信度較高。

蛋白質的疏水性分析是蛋白質二級結構以及三級結構預測中一個必要過程，通過分析可以得到蛋白質的親疏水區域，一方面為二級結構預測結果提供參考，另一方面為結構域以及功能域的劃分提供依據。因此，對不結球白菜BcGAPDH氨基酸序列進行疏水性分析，結果（圖2）表明，多肽鏈第304位的氨基酸具有最低分值-4.500，親水性最強；第212位的氨基酸具有最高分值4.200，疏水性最強。整體來看，親水性氨基酸均勻分布在整個肽鏈中，且多于疏水性氨基酸。因此，整個多肽鏈表現為親水性，沒有明顯的疏水區域，可認為不結球白菜BcGAPDH是親水性蛋白質。結合跨膜結構域的預測結果，可以推斷不結球白菜BcGAPDH不存在明顯的疏水區域，與其不存在跨膜結構域的特征相吻合。

2.3 不結球白菜BcGAPDH信號肽及亞細胞定位的預測和分析

信號肽分析有助于蛋白質功能域的區分及蛋白質細胞定位。SignalP v3.0軟件是神經網絡、隱馬爾科夫模式工具[12]，將不結球白菜BcGAPDH的ORF通過該軟件分析（圖3），獲得ORF的Cmax值為0.083、Ymax值為0.083、Smean值為0.561、Smean值為0.182，前3個值的位點分別在第25、25、1位。根據軟件的默認選擇，將Cmax值>0.5和Smean值>0.5的ORF確定為具有信號肽。根據分析結果，此信號肽計算結論為NO，表示沒有信號肽存在。

對基因產物在亞細胞位置的了解對判定這些基因產物的功能起著重要作用。用Target P server程序進行不結球白菜BcGAPDH蛋白質的亞細胞定位，結果表明，基本確認BcGAPDH蛋白質在線粒體中發揮生物學作用，氨基酸序列長度為328個，定位于葉綠體、線粒體和其他細胞部分的得分分別為0.031、0.745、0.572，作為信號肽的可能性為0.018，軟件的最終定位預測在線粒體，可信度為5。用 Subloc V server和WOLFPSORT server程序進行驗證分析，結果一致。

2.4 不結球白菜BcGAPDH蛋白質的模體分析

將不結球白菜BcGAPDH蛋白質的氨基酸序列利用在線軟件ScanProsite進行分析，發現其含有多種模體位點（圖4），其中包括1個氨基化合物位點（M1），1個依賴于cAMP或cGMP的蛋白質激酶磷酸化位點（M2），6個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點（M3），3個N-糖基化位點（M4），6個N-肉豆蔻酰化位點（M5），4個蛋白質激酶C磷酸化位點（M6）。

2.5 不結球白菜BcGAPDH蛋白質二級結構的預測分析

利用SOPMA在線工具預測不結球白菜 BcGAPDH蛋白質的二級結構，結果如圖5所示，BcGAPDH含有比較豐富的二級結構，由112個氨基酸殘基組成α螺旋結構，占全部氨基酸殘基的34.15%；82個氨基酸殘基組成延伸鏈，占全部氨基酸殘基的25.00%；由21個氨基酸殘基組成β轉角，占全部氨基酸殘基的6.40%；由113個氨基酸殘基組成隨機卷曲，占全部氨基酸的34.45%。可以看出，隨機卷曲和α-螺旋是BcGAPDH多肽鏈中的主要結構元件，延伸鏈散布于整個蛋白質中。

2.6 不結球白菜BcGAPDH蛋白質三維結構的預測

將不結球白菜BcGAPDH氨基酸序列上傳到SWISS-MODEL的建模服務器中進行三維建模[13，14]，然后在ViewerLite 4.2軟件中進行序列編輯，獲得BcGAPDH的三級結構模型，結果如圖6所示。

3 討論

GAPDH生物學的多功能性基于不同的研究結果，這些新的發現可以分為2組：第1組包括鑒定GAPDH新活性的研究，結果發現GAPDH有別于傳統的脫氫酶活性的新功能；第2組包括鑒定GAPDH與細胞內大分子的特異性結合，為GAPDH新功能提供了重要證據。

早期的研究證明GAPDH是一個膜結合蛋白[15]，發現細胞中60%～70%的GAPDH能與膜結合，但不結球白菜BcGAPDH不具有該活性，因為通過本試驗分析該酶無跨膜區，是親水性蛋白質。另外，研究表明，GAPDH還具有磷酸轉移酶/激酶的活性，不僅能自身磷酸化，而且還能磷酸化其他蛋白質。本試驗對不結球白菜BcGAPDH蛋白質的模體分析發現，該酶包括蛋白質激酶磷酸化位點、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點和蛋白質激酶C磷酸化位點，表明BcGAPDH在不結球白菜體內具有磷酸化活性，BcGAPDH在其細胞病毒生理學上可能扮演著重要角色。

GAPDH廣泛存在于眾多生物體中，并且具有高度種屬保守序列，它作為一個多功能蛋白質，其結構與功能的關系仍有待研究。目前，GAPDH在機體的生理和病理狀態下的作用越來越引起有關學者的關注。但迄今為止，GAPDH在細胞中的功能還沒有完全搞清楚，因此，本試驗對不結球白菜BcGAPDH結構和功能的分析將有助于研究者進一步了解GAPDH反應的機制及所需條件。

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