安徽省小麥赤霉病菌群體遺傳多樣性AFLP分析

盧麗斌，陳 莉，宛 瓊，丁克堅

(安徽農業大學植物保護學院，安徽合肥 230036)

安徽省小麥赤霉病菌群體遺傳多樣性AFLP分析

盧麗斌，陳 莉，宛 瓊，丁克堅

(安徽農業大學植物保護學院，安徽合肥 230036)

為了解安徽省小麥赤霉病菌的群體分化和遺傳變異規律，利用AFLP技術對安徽省4個地理群體的68個供試菌株進行了群體遺傳多樣性分析。結果表明，8對引物共擴增出245條帶，供試菌株間的遺傳距離為0.014～0.021。4個小麥赤霉病菌群體之間的遺傳距離與地理分布沒有明顯的相關性。4個赤霉病菌群體的Shannon信息指數I為0.321，基因多樣性指數H為0.193，表明具有一定的遺傳多樣性。方差分析表明，被測小麥赤霉病菌群體的遺傳變異主要存在于群體內(99.80%)，群體間的遺傳變異僅占0.20%。4個赤霉病菌群體間存在較低的遺傳分化(Gst=0.049)和頻繁的基因交流(Nm=9.648)。相比較而言，北部群體和中部群體親緣關系較近，而南部群體和中、北部群體親緣關系較遠。

安徽；小麥赤霉病菌；遺傳多樣性；擴增片段長度多態性

小麥赤霉病主要分布在濕潤及半濕潤地區。近年來，隨著全球氣候變暖和農作物耕作制度的改變，小麥產區赤霉病的發生面積越來越大，重發生年份出現的頻率也逐漸增加。該病害不僅造成小麥嚴重減產[1]，病菌在侵染過程中還產生多種真菌毒素(如DON和NIV)及次生代謝產物污染糧食，引起人畜嘔吐、腹痛等中毒癥狀，嚴重威脅人和動物的健康[2]。

DNA分子標記技術是用特征性DNA片段來反映生物個體或者群體間基因組的某種差異。目前，已經建立起來的分子標記技術達十多種[3]。AFLP(擴增片段長度多態性)僅需少量引物即可獲得較多標記，受環境影響小，分辨率高，經兩步選擇擴增，帶型穩定，靈敏度高，重復性好，被稱為最有力的分子標記技術[3]，在遺傳多樣性研究中得到了廣泛的應用。Quellet和Seifert[4]利用隨機擴增多態性的分子標記對禾谷鐮刀菌的遺傳特性進行研究，開創了分子水平對鐮刀菌進行種型鑒定的先河。Qu等[5]對我國不同地區的437個菌株進行了SCAR(特定序列擴增)和AFLP分析。Yang等[6]利用SNP(單核苷酸多態性)對從大麥種中分離出的1 894個菌株進行分析。劉 恒等[7]利用AFLP技術對陜西省小麥赤霉病菌的遺傳多樣性進行了分析，結果表明不同區域的禾谷鐮刀菌之間的遺傳背景存在多樣性，群體間有明確的地理分布特征，可以分為A、B兩大生態適應性類型。

安徽省地處我國南北過渡地帶，是小麥赤霉病主發區。為了解安徽省小麥赤霉病菌群體遺傳變異特點及系統演化機制，本研究利用AFLP技術對安徽省4個地理群體的68個鐮刀菌進行群體遺傳多樣性研究，分析其群體分化和遺傳變異規律，以期為進一步明確小麥赤霉病菌的遺傳變異規律、指導病害科學防治提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

本試驗用小麥赤霉病菌，均來自安徽省主要農作物品種抗病性鑒定與研究中心菌種庫，菌株采集時間為2009-2015年。各菌株來源及編號見表1。

1.1.2 供試引物

參考Justesen等[ 8]的引物，篩選出8對多態性好、譜帶清晰、重復性好的選擇性擴增引物，并在每對選擇性引物的MseI鏈的5′端加上相應的熒光(上海生物工程技術有限公司合成)，引物信息見表2。

表1 供試菌株信息

Table 1 Information of the tested stains

群體Population采集地Location菌株Strain菌株編號及數量Nameandnumbersofthestrain皖北淮北Huaibei碭山Dangshan(ds)、宿州Suzhou(sz)ds1，sz1，sz2，sz315NorthofAnhui(HB)亳州Bozhou渦陽Guoyang(gy)、亳州Bozhou(bz)gy1，gy2，gy3，gy4，bz1蒙城Mengcheng(mc)、利辛Lixin(lx)mc1，mc2，mc3，mc4，mc4-，lx1沿淮蚌埠Bengbu鳳陽Fengyang(fy)、懷遠Huanyuan(hy)fy1，fy2，fy3，hy1，hy223AlongtheHuairiver(BF)淮南Huainan固鎮Guzhen(gz)、淮南Huainan(hn)gz1，gz2，gz3，hn1，hn2阜陽Fuyang鳳臺Fengtai(ft)、壽縣Shouxian(sx)ft1，ft2，ft3，ft4，sx1阜陽Fuyang(fuy)fuy1，fuy2，fuy3，fuy3-潁上Yingshang(ys)ys1，ys2，ys3，ys3-江淮之間合肥Hefei巢湖Chaohu(ch)、廬江Lujiang(lj)ch1，ch2，ch3，ch4-，lj119Jianghuaicenter(HC)六安Luan長豐Changfeng(cf)、定遠Dingyuan(dy)cf1，cf2，dy1，dy2滁州Chuzhou六安Luan(la)、霍邱Huoqiu(hq)la1，la2，la3，la4，la5，hq1金寨Jinzhai(jz)、滁州Chuzhou(cz)jz1，jz2，jz3，cz1沿江安慶Anqing蕪湖Wuhu(wh)、含山Hanshan(hs)wh1，wh2，hs111Alongtheriver(WX)銅陵Tongling安慶Anqing(aq)aq1，aq2，aq3，aq4宣城Xuancheng潛山Qianshan(qs)、績溪Jixi(jx)qs1，jx1銅陵Tongling(tl)、宣城Xuancheng(xc)tl1，xc1Anhui安徽Anhui68

菌株編號后面帶“-”為Fusariumgraminearum(Fg)菌株，沒有標注的為Fusariumasiaticum(Fa)菌株。

- following the strain number represents theFusariumgraminearum(Fg),others wereFusariumasiaticum(Fa).

表2 AFLP技術所用引物及序列

Table 2 Primers and corresponding sequences used for AFLP analysis

引物名稱Primer引物序列(5′?3′)Sequence(5′?3′)修飾熒光Labeledfluorescence擴增條帶數目No．ofpolymorphicbandsPstI?adapterTGTACGCAGTCTACCTCGTAGACTGCGTACATGCAMseI?adapterTACTCAGGACTCATGACGATGAGTCCTGAGPstI0GTAGACTGCGTACATGCAGMseI0GACGATGAGTCCTGAGTAAM11/P19MseI0+AA/PstI0+GAROX24M11/P20MseI0+AA/PstI0+GCROX39M12/P23MseI0+AC/PstI0+TAFAM20M12/P24MseI0+AC/PstI0+TCFAM57M14/P11MseI0+AT/PstI0+AAHEX33M14/P25MseI0+AT/PstI0+TGHEX22M20/P23MseI0+GC/PstI0+TATAMRA25M20/P25MseI0+GC/PstI0+TGTAMRA25

MseI0+AA:MseI0引物(5′-GACGATGAGTCCTGAGTAA-3′)加上2個選擇性堿基(AA)；PstI0+GA:PstI0引物(5′-GTAGACTGCGTACATGCAG-3′) 加上2個選擇性堿基(GA)。

MseI0+AA:MseI0 primer(5′-GACGATGAGTCCTGAGTAA-3′) plus two selective nucleotides(AA);PstI0+GA:PstI0 primer(5′-GTAGACTGCGTACATGCAG-3′) plus two selective nucleotides(GA).

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取

收集PDA培養基上培養的菌絲，采用CTAB法[9]提取基因組DNA，利用Nanodrop 2000(上海在途生物科技有限公司)測定DNA的純度和濃度，-20 ℃保存備用。

1.2.2 AFLP檢測

AFLP檢測參考Justesen等[ 8]方法，首先利用MseI和PstI兩種限制性內切酶對基因組DNA進行雙酶切，并在T4-DNA Liagase作用下進行連接。37 ℃水浴中酶切連接10.5 h后，PCR儀中65 ℃滅活20 min。酶切連接產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，再利用引物MseI0和PstI0(具體序列見表2)對酶切連接產物進行預擴增，將預擴增產物進行選擇性擴增，最后將選擇性擴增產物利用遺傳分析儀進行譜帶分析。

1.2.3 數據分析

利用Gene marker 2.2.0軟件對AFLP擴增譜帶進行讀數，相同遷移位置上有電泳條帶的個體記為“1”，無條帶的記為“0”，不確定條帶的記為“2”，建立0、1二元數據矩陣，作為分析的原始數據。

將供試菌株按照地理分布劃分為4個群體，采用軟件Popgene Version 1.32計算各個群體的遺傳距離。用軟件NTSYSpc version 2.1以及類平均聚類法(UPGMA)構建系統聚類樹。

采用軟件Popgene Version 1.32計算安徽省小麥赤霉病菌總群體和各個群體的多態位點比率(P)、觀測等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、Nei′s基因多樣性指數(H)、Shannon′s信息指數(I)、群體分化系數(Gst)和基因流(Nm)。

利用Multilocus 1.32軟件計算安徽省小麥赤霉病菌的AFLP基因型頻率，并計算總群體及各亞群體的基因型多樣性。

利用Genalex 6.5軟件中的分子方差分析(AMOVA)計算安徽省小麥赤霉病菌的φpt參數。為了進一步分析各亞群體間的遺傳差異，將安徽省小麥赤霉病菌各菌株之間的遺傳距離轉換成構建特征向量和特征值后，尋找群體的分散幅度，利用軟件中的PCoA方法作圖。

運用Structure 2.2軟件對安徽省68個小麥赤霉病菌株進行遺傳類群的劃分。

2 結果與分析

2.1 AFLP結果分析

利用8對多態性高且條帶豐富的引物組合M11/P19、M11/P20、M12/P23、M12/P24、M14/P11、M14/P25、M20/P23、M20/P25對供試病菌群體進行多樣性分析，對條帶進行統計，共得到245個位點，平均每組引物為30.625個位點；8對引物擴增的條帶數在20～57之間，其中 M12/P24擴增的條帶數最多，為57條(表2)。

2.2 聚類分析

按照小麥赤霉病菌在安徽省的地理分布，由北往南將68個菌株分別劃分為皖北(HB)、沿淮(BF)、江淮之間(HC)、沿江(WX)4個群體進行遺傳多樣性分析(表1)。由表3可知，4個群體的遺傳距離為0.014～0.021，遺傳相似系數在0.980～0.988之間，表明4個群體間的遺傳差異不明顯，親緣關系較近。

表3 4個群體之間的遺傳相似系數(右上方)和遺傳距離(左下方)

Table 3 Genetic similarity coefficients(upper right) and genetic distance(lower left) between four populations

群體PopulationHBBFHCWXHB0．9860．9880．980BF0．0140．9860．983HC0．0120．0140．987WX0．0210．0170．014

根據遺傳距離，構建4個群體間的系統聚類圖(圖1)。由圖1可以看出，安徽北部兩個群體(HB、HC)和中部群體(BF)親緣關系較近，而安徽南部群體(WX)和其他三個群體親緣關系較遠。

圖1 4個群體的聚類圖

2.3 遺傳多樣性分析

由表4可知，安徽省小麥赤霉病菌群體總的多態性位點比例P為100%；基因多樣性指數H為0.193；信息指數I為0.321，表明安徽省小麥赤霉病菌群體具有一定的遺傳多樣性水平。群體間的遺傳分化系數為0.022～0.033，基因流為14.905～22.412；表明安徽省4個群體間存在較低的遺傳分化、頻繁的基因交流。

表4 安徽省小麥赤霉病菌群體的遺傳多樣性

Table 4 Genetic diversity ofF.graminearumin Anhui province

群體Population多態性位點Pl/%觀測等位基因數Na有效等位基因數Ne基因多樣性指數H信息指數I群體分化系數Gst基因流NmAnhui100．002．0001．2920．1930．3210．0499．648HB、BF95．101．9511．3030．1970．3250．02916．525HB、BF、HC98．371．9841．2940．1940．3220．02222．412HB、BF、WX99．591．9961．2990．1960．3240．03314．905HC、WX82．861．8291．2720．1790．2940．03115．652

Pl:Polymorphic loci;Na:Observed number of alleles;Ne:Effective number of alleles;H:Nei′s gene diversity;I:Shannon′s information index;Gst:Genetic differentiation coefficient;Nm:Estimation of gene flow fromGst.

2.4 基因型分析

將得到的每個AFLP基因型進行人為命名，按順序編號，如ah6代表安徽第6個基因型。結果顯示，68個菌株可分為27個基因型，基因型多樣性為0.40，表明被測小麥赤霉病菌群體的AFLP基因型有一定的多樣性；HB、BF、HC和WX群體基因型多樣性分別為0.53、0.57、0.74、0.82(表5)，其中HC、WX群體較高，均超過 0.70。 4個群體中，群體間的共有基因型最少有3個(HB與BF)，最多有7個(HC與WX)，共有基因型占各群體基因型的比例介于23.10%～77.80%之間，表明各群體間存在著不同程度基因型交流；其中，ah4基因型菌株占比最高。

2.5 遺傳結構和遺傳分化

由表6可知，4個小麥赤霉病菌群體間的遺傳分化水平差異不顯著(P=0.387)；來自群體內部的遺傳變異高達99.80%，群體間的變異僅占0.20%，表明其遺傳變異主要來源于群體內部。

為了進一步分析各亞群體間的遺傳差異，將安徽省小麥赤霉病菌各菌株之間的遺傳距離轉換成特征向量和特征值后，尋找小麥赤霉病菌群體的分散幅度，利用Genalex 6.5軟件中的PCoA方法作圖。由圖2可以看出，4個類群主要分為2大類，大部分菌株分布于第一、三象限，小部分菌株分布于第二、四象限，但4個群體均有較多部分的重疊，沒有出現自成一類的群體，與之前的聚類分析結果一致。

2.6 群體結構

設置K值為2～12，即將安徽省68個供試菌株劃分為2～12個亞群，每個K值分別運行6次，以每個K值為橫坐標，以相應的△K值為縱坐標做折線圖(圖3)。從圖3可以看出，當K值為4時，獲得了最大的ΔK值，所以最終確定K值為4，將所有供試菌株劃分為4個亞群。

表5 安徽省小麥赤霉病菌群體的基因型多樣性及各AFLP基因型在群體中的分布

Table 5 Genotypic diversity and the distribution of the corresponding AFLP genotypes obtained in Anhui province

采集地Collectionplace分離物數目Numbersofisolate基因型數目Numbersofgenotype基因型多樣性GenotypicdiversityAFLP基因型(相應的分離物數目)AFLPgenotype(Numbersofthecorrespondingisolates)皖北 HB1580．53ah1(1)，ah2(1)，ah3(2)，ah4(6)，ah5(1)，ah6(2)，ah7(1)，ah8(1)沿淮 BF23130．57ah2(2)，ah4(4)，ah7(1)，ah9(1)，ah10(4)，ah11(1)，ah12(1)，ah13(1)，ah14(1)，ah15(1)，ah16(3)，ah17(1)，ah18(1)江淮之間 HC19140．74ah4(2)，ah6(1)，ah7(2)，ah10(2)，ah13(2)，ah15(2)，ah19(1)，ah20(1)，ah21(1)，ah22(1)，ah23(1)，ah24(1)，ah25(1)，ah26(1)沿江 WX1190．82ah4(2)，ah6(1)，ah7(2)，ah12(1)，ah13(1)，ah15(1)，ah22(1)，ah26(1)，ah27(1)

表6 安徽省小麥赤霉病菌4個類群AFLP數據的方差分析(AMOVA)結果

Table 6 AMOVA among and with inF.graminearumpopulations in Anhui Province

變異來源Sourceofvariation自由度Df總方差SSD均方差MSE變異%Est．Var變異系數φptP群體間Amongpopulations373．97224．6570．200．0020．387群體內Withinpopulation641533．41023．96099．80合計total671607．382100．00

圖2 安徽省小麥赤霉病菌4個類群AFLP數據的PCoA載荷圖

利用Structure 2.2軟件中的混合線性模型聚類法來推斷群體結構，作安徽省小麥赤霉病菌的群體結構分析圖(圖4)，由圖4可以看出，將供試菌株分為4個亞群，從左往右依次為亞群1，亞群2，亞群3和亞群4。

圖4表明，68個小麥赤霉病菌菌株可分為4個亞群，除了WX類群在第二亞群中沒有分布外，

其余每個類群在4個亞群中均有分布，且同一地區的不同菌株并不完全分布在同一亞群中，群體結構趨向多樣化，沒有出現自成一類的群體。該結果與主成分分析和UPGMA聚類的結果較為一致。

圖3 K與△K的關系

3 討 論

本研究利用8對多態性高的AFLP引物，擴增得到245個位點，能夠準確反映安徽省小麥赤霉病菌群體的遺傳多樣性。所用AFLP引物的擴增譜帶清晰穩定，且擴增出的譜帶多態性比例較高。

聚類分析結果表明，安徽省小麥赤霉病菌遺傳距離差異不明顯，且親緣關系與地理位置之間沒有明顯的相關性。這一結果與許 娟和丁克堅[10]通過RAPD -PCR、ISSR-PCR聚類分析的結果一致。

橫軸數值代表菌株編號，豎軸為屬于某個群體的概率；紅色：亞群1；綠色：亞群2；藍色：亞群3；黃色：亞群4。

The horizontal axis represents strain number, and vertical axis is the probability of membership of a group. Red:Subgroup 1; Green Subgroup 2; Blue:Subgroup 3; Yelow:Subgroup 4.

圖4 安徽省68個小麥赤霉病菌的聚類結果

Fig.4 Clustering results of 68F.graminearumstrains in Anhui

從Nei′s遺傳多樣性指數來看，安徽省小麥赤霉病菌群體的相關遺傳參數(H=0.193)低于AFLP、ISSR 等3種顯性標記統計的25種廣布植物的平均水平(H=0.220)[11]，表明安徽省小麥赤霉病菌群體的遺傳多樣性不夠豐富。這一結果與胡光榮等[12]對我國禾谷鐮刀菌群體的遺傳多樣性鑒定結果不一致，這可能與安徽省的獨特地理位置及種植品種有關。安徽省地處南北氣候過渡帶，耕作制度復雜，屬于赤霉病流行區。高產創建以來，小麥品種的布局變化比較大，皖北、皖西北和中部麥區以冬性和半冬性品種為主，淮河以南及沿江麥區則以春性品種為主。

安徽省小麥赤霉病菌的遺傳分化系數(Gst)為0.049，低于基于AFLP標記的12個物種的平均水平(Gst=0.210)[11]，也低于9個廣布物種的平均水平(Gst=0.330)[11]，這表明安徽省小麥赤霉病菌不同群體間遺傳分化不顯著。這與Gale等[13]采用RFLP方法對浙江省3個地區的小麥赤霉病菌群體進行分析的結果一致。

本研究中，基因流Nm為9.648，遠大于1，說明群體間存在頻繁的基因流動。小麥赤霉病屬于氣候型病害，頻繁的基因交流可能與小麥赤霉病借氣流、風雨傳播有關。

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Analysis of Genetic Diversity of Fusarium graminearum in Anhui Province by AFLP

LU Libin,CHEN Li,WAN Qiong,DING Kejian

(School of Plant Protection, Anhui Agricultural University, Hefei, Anhui 230036,China)

In order to understand the population different and genetic variation ofFusariumgraminearumin Anhui province, the genetic diversity of 68 strains was analyzed by AFLP, and the strains were divided into four groups according to their geographical distribution. The results showed that there were 245 bands amplified by eight pairs of primers, and the genetic distances among the tested strains were arranged in 0.014～0.021. There was no significant correlation between the genetic distance and the geographical distance of the four geographical populations in Anhui province. The Shannon information indexIwas 0.321, and the gene diversity indexHwas 0.193, which indicated that a certain level of genetic diversity existed inF.graminearumpopulation in Anhui. Analysis of molecular variance showed that the most genetic variation existed within populations(99.80%) and a little genetic variation existed among populations(only 0.20%). A lower genetic differentiation(Gst=0.049) existed among the four geographic populations, and a frequent gene exchange(Nm=9.648) existed among them. Compared with the genetic relationship between the southern population and the northern population ofF.graminearumin Anhui province, the genetic relationship between the northern population and the central population was closer.

Anhui;Fusariumgraminearum; Genetic diversity; Amplified fragment length polymorphism

2016-05-05

2016-05-20

國家公益性行業(農業)科研專項(201503130)

E-mail：867688050@qq.com 通訊作者：陳 莉(E-mail:chenli31029@163.com)

時間：2016-12-07

S512.1；S435

A

1009-1041(2016)12-1681-07

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20161207.1751.038.html