黑麥減數分裂染色體標本制作實驗研究

丁海燕，訾曉雪

(大慶師范學院，黑龍江大慶 163712)

黑麥減數分裂染色體標本制作實驗研究

丁海燕，訾曉雪

(大慶師范學院，黑龍江大慶 163712)

為探索一套適合本科生在有限的課堂時間內操作并且效果良好可用于后續的分帶、原位雜交方面研究的減數分裂染色體標本制作技術，使用卡寶品紅、醋酸洋紅對黑麥花藥材料進行染色，采用叔丁醇脫水揭片法和冰凍揭片法對制作好的臨時裝片進行揭片，明確不同染色方法及不同揭片方法對標本制作效果的影響。結果表明，卡寶品紅染色制得的標本顏色飽滿鮮艷，適合本科實驗教學使用；醋酸洋紅染色獲得的標本顏色淺紅，更適合原位雜交等研究使用。叔丁醇脫水揭片法在脫水過程中花粉材料易與載玻片分離，材料易丟失；低溫冷凍揭片法保證材料完好，操作簡單。使用卡寶品紅染色與冷凍揭片法制得的減數分裂各個時期的永久標本，染色體圖像清晰，分裂相動態連續，可用于實驗教學，也可用于原位雜交等方面的研究。

黑麥；減數分裂；染色體標本

減數分裂過程中染色體行為的觀察是本科生遺傳學實驗教學的重要內容，制得減數分裂各個時期的動態連續的染色體標本，是提高教學質量的重要手段[1]。同時，制作良好的減數分裂染色體標本，對原位雜交、染色體分帶等方面的研究也尤為重要[2]。前人在減數分裂染色體標本制作方面的研究較多，如李森華[3]用卡寶品紅染色和冰凍機冰凍揭蓋片的方法，對黑麥減數分裂各時期的染色體行為進行了研究；段增強等[4]改進了傳統植物細胞減數分裂染色體制片技術，探索了用醋酸洋紅染色3～5 min，并反復加熱，然后烘干揭片的制片方法。但是較多的工作集中在用于顯帶、原位雜交等方面的染色體制片研究上，而針對本科生實驗教學的染色體標本制作方面的研究比較少，而且黑麥是遺傳學實驗的常用材料[5]，關于黑麥減數分裂染色體標本制作的研究非常少。因此，本研究以黑麥為材料，使用卡寶品紅、醋酸洋紅對其花藥進行染色，采用叔丁醇脫水揭片法和冰凍揭片法對制作好的臨時裝片進行揭片，明確不同染色方法及不同揭片方法對標本制作效果的影響，旨在探索適合本科生在有限的課堂時間內操作并且效果良好可用于后續的分帶、原位雜交方面研究的減數分裂染色體標本制作技術。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為勝利黑麥。

1.2 試 劑

卡寶品紅染液[6]:3 g堿性品紅溶于100 mL 70%乙醇中，此為原液A。取原液A 10 mL，加入90 mL 5%的苯酚水溶液，充分混均后，置于37 ℃溫箱中2～4 h，此為原液B。取原液B 55 mL，加入甲醛、冰醋酸各6 mL充分混勻，此為原液C。配置染液時，取原液C 10～20 mL，加入80～90 mL 45%冰醋酸和1 g山梨醇。

1%醋酸洋紅染液[7]:150 mL 45%的冰醋酸，煮沸后停止加熱，加入1.5 g洋紅(進口分裝)粉末，一邊加熱一邊攪拌至完全溶解，當45%的冰醋酸的量減少時，再加入相應量的45%的冰醋酸，煮沸約30 min，煮沸時將生銹的小鐵釘放入染色液一同煮。之后將染液在室溫下靜置冷卻，冷卻之后過濾，染液貯存于棕色瓶，貯存于4 ℃冰箱中。

叔丁醇脫水揭片法的四種溶液[8]:1、45%醋酸與95%乙醇以1∶1的比例混合；2、95%叔丁醇；3、95%乙醇與叔丁醇以1∶1的比例混合；4、叔丁醇。分別盛在編號為1～4的四個燒杯中。

其他藥品:70%乙醇、95%乙醇、鹽酸、45%冰醋酸、中性樹膠。

1.3 方 法

1.3.1 麥穗的選取與處理

黑麥旗葉還未完全展開，距離第一節大約10 cm時，剪取花苞，將麥穗取出，卡諾固定液中4 ℃固定24 h，70%乙醇沖洗3次，置于70%乙醇中，在4 ℃冰箱保存備用[9]。

1.3.2 花藥的選擇

在取材時應注意，同一穗上不同部位的小花中的花藥分裂時期有所不同，同一小花中的花藥所處的分裂期大致相同。在同一麥穗中一般以長在中部的小穗最先發育，依次向上向下推移，每一小穗中各個小花的發育順序則由下向上推移，即第1朵小花比第2朵小花早一個分裂時期，但越到后來分裂時期越接近。如以花藥長度來看，大致在3 mm左右時的花藥應為黃綠色，綠色則太嫩，黃色則太老。同一朵小花中3個花藥幾乎處于同一分裂時期，一般選取較長的花藥制片[10]。

1.3.3 花藥的染色與制片

從固定的花序中按由下到上的順序取幾個小花，用鑷子在每個小花中分別取出兩個花藥，一個放在1%醋酸洋紅染液中，另一個放在70%乙醇中，并均于4 ℃冰箱保存。經醋酸洋紅染色的花藥要在至少一周后才可用于壓片[11]，而在70%乙醇中的花藥可以隨時取出壓片。70%乙醇中的花藥壓片方法如下:將花藥取出后放在載玻片上，用刀片切割下一小段花藥，先用竹簽輕輕按壓幾下，擠出花粉母細胞，將剩余的花藥放在另外一個載玻片上并滴加一滴45%醋酸防止干燥，將原載玻片上的一小段花藥滴上一滴卡寶品紅染液，染色3～5 min后加上蓋玻片，將刀片夾在蓋玻片與載玻片之間，左手食指按在蓋玻片的左下角，右手持一竹簽在花藥周圍敲擊，待花藥中的花粉母細胞分散后即可，之后把制片在酒精燈外焰上過幾次，但加熱時間不可過長，時間過長則容易使材料烤焦，時間過短則之后在揭片時容易使材料脫離載玻片[12-13]，加熱后立即在蓋玻片上覆兩塊濾紙，用拇指垂直按壓制片[14]，注意在壓片過程中不要讓蓋玻片移動。1%醋酸洋紅染液中的花藥壓片方法如下:將染色一周的花藥取出后，用刀片切取一小段花藥，滴一滴45%醋酸后加上蓋玻片，將刀片夾在蓋玻片與載玻片之間，之后，用與上文同樣的方法制片。

1.3.4 鏡檢及揭片

先在低倍鏡下找到具有分裂相的花粉母細胞，然后依次轉換到高倍鏡觀察辨認該時期位于減數分裂的哪個時期。分裂相較好的臨時裝片要制作成永久裝片。首先要進行脫片，脫片的目的是使臨時壓制的片子的蓋玻片與載玻片分離。本實驗采用的脫片方法有兩種，即冷凍揭片法和叔丁醇脫水揭片法。冰凍揭片法[15]:把臨時壓制的片子放在-80 ℃的冰箱內，使片子迅速凍結，2 h后用刀片迅速揭開蓋片，以免片子上的水分融化，使材料丟失。叔丁醇脫水揭片法[16]:將臨時裝片的蓋玻片那面朝下，傾斜放在1號燒杯中，讓蓋玻片自然脫落，然后用鑷子夾取蓋玻片和載玻片，再依次在2～4號燒杯的溶液中處理。在每個燒杯中分別浸泡5 min左右取出。

1.3.5 干燥及封片

在蓋玻片與載玻片分離后，將載玻片有材料的一面朝上放置在培養皿中，于60 ℃的烘箱中干燥[17]。干燥10 h后，將一滴中性樹膠滴在載玻片上的材料上，取一干凈的蓋玻片輕輕附于其上，平放即可，切記不可壓片。做好的裝片放在干凈通風處進行干燥，待樹膠干燥后，即為永久裝片。

2 結果與分析

2.1 染色方法對標本制作效果的影響

實驗比較了醋酸洋紅染色和卡寶品紅染色的效果。使用醋酸洋紅染色所得的永久片在顯微鏡下觀察時，染色體著色很淺，圖像呈淺紅色(圖1A)。使用卡寶品紅染色所得的永久片在顯微鏡下觀察時，染色體著色很深，圖像呈紫色，顏色鮮艷，易于觀察(圖1B)。醋酸洋紅染色周期較長，一般至少7 d才能上色。卡寶品紅染色時間很短，一般3～5 min即可，適合本科學生在遺傳學實驗課中使用。

2.2 揭片技術對標本制作效果的影響

實驗比較了叔丁醇脫水揭片法與低溫冷凍揭片法對標本制作效果的影響。叔丁醇脫水揭片法在許多文獻中都有所提及，但是通過實驗發現，此法不易操作、難度較大，在脫水過程中花粉細胞便與載玻片分離，最終沒有通過這種方法得到永久片。低溫冷凍揭片法效果很好，只需將臨時裝片壓片后放入-80 ℃的冰箱中冷凍數小時之后取出揭片即可，而且方便、安全。實驗所得的永久片全部由此法獲得。

2.3 第一次減數分裂標本的制作

使用卡寶品紅染色、醋酸洋紅染色、低溫冰凍揭片的方法制作了黑麥第一次減數分裂標本，效果良好。圖2D為醋酸洋紅染色的標本效果，圖2中其他圖像為卡寶品紅染色的標本效果。

第一次減數分裂時，同源染色體發生聯會，交叉互換。之后，同源染色體分開，非同源染色體自由組合。此時期可分為:前期Ⅰ、中期Ⅰ、后期Ⅰ、末期Ⅰ。其中，前期Ⅰ又包括細線期、偶線期、粗線期、雙線期和終變期。細線期時染色質凝縮成可見的細線(圖2A)。偶線期時同源染色體沿著縱長方向配對(圖2B、圖2C)。偶線期早期階段和晚期階段是動態連續的過程，但是學生在實驗操作和觀察時卻往往不能同時看到，這樣的變化過程呈現給學生，加深了對染色體動態變化的理解。粗線期同源染色體聯會基本完成，每個二價體都能清晰可見，此時染色體比偶線期要短，粗線期較早階段的染色體形態和較晚階段的染色體形態差異較大(圖2D、圖2E)，較晚階段的粗線期染色體形態與雙線期的較早階段很像，如果單獨觀察較難區分。雙線期時聯會復合體解體，同源染色體相互排斥，染色體出現或大或小的交叉(圖2F)。終變期時染色體繼續縮短變粗(圖2G)。中期Ⅰ時染色體排布在赤道板上，且每個染色體顆粒中包含四條染色單體，中期Ⅰ(圖2H、圖2I)較早的階段染色體形態與終變期的較難區分。后期Ⅰ時紡錘絲附著在著絲點上，同源染色體向兩極移動(圖2J、圖2K)，此時可隱隱見到紡錘絲。末期Ⅰ時染色體達到兩級，赤道板處形成細胞板，一個性母細胞分裂形成兩個，每個新的細胞呈現月牙狀(圖2L)。

在實驗教學課堂上，兩個連續動態的染色體標本同時呈現給學生，學生會深刻理解減數分裂過程的動態連續性，會很容易區分和掌握它們的特征。

a:細線期；B:偶線期(早)；C:偶線期(晚)；D:粗線期(早)；E:粗線期(晚)；F:雙線期；G:終變期；H:中期Ⅰ(早)；I:中期Ⅰ(晚)；J:后期Ⅰ(早)； K:后期Ⅰ(晚)；L:末期Ⅰ。

a:Leptotene stages；B:Zygotene stages(early)；C:Zygotene stages(late)；D:Pachytene stages(early)；E:Pachytene stages(late)；F:Bifilar stages；G:Diakineses；H:Metaphase Ⅰ(early)；I:Metaphase Ⅰ(late)；J:Anaphase Ⅰ(early)；K:Anaphase Ⅰ(late)；L:Telophase Ⅰ.

圖2 第一次減數分裂的標本圖像

Fig.2 Specimen images of meiosis Ⅰ

2.4 第二次減數分裂標本的制作

使用卡寶品紅染色、醋酸洋紅染色、低溫冰凍揭片的方法制作了黑麥第二次減數分裂標本。圖3D為醋酸洋紅染色的標本效果，圖3中的其他圖像為卡寶品紅染色的標本效果。

第二次減數分裂中，姐妹染色體分開，非姐妹染色單體自由組合。第二次減數分裂包括:前期Ⅱ、中期Ⅱ、后期Ⅱ和末期Ⅱ。前期Ⅱ持續時間較短，表現為染色體逐漸縮短變粗(圖3A)，每條染色體中都包著兩條染色單體。中期Ⅱ時細胞內出現紡錘絲，每條染色體的著絲粒都排列在赤道板上，在顯微鏡下可見兩個呈半月形的中期細胞相鄰的排列在一起(圖3B)。后期Ⅱ時姐妹染色單體分開，移向兩級在顯微鏡下可見兩個呈半月形的后期細胞相鄰的排列在一起(圖3C)。末期Ⅱ時姐妹染色單體移動到細胞的兩級，在赤道板處形成細胞板，在顯微鏡下可見炸藥包結構(圖3D)，即形成了四個子細胞。

a:前期Ⅱ；B:中期Ⅱ；C:后期Ⅱ；D:末期Ⅱ。

a:Prophase Ⅱ；B:Metaphase Ⅱ；C:Anaphase Ⅱ；D:Telophase Ⅱ.

圖3 第二次減數分裂的標本圖像

Fig.3 Specimen images of meiosis Ⅱ

3 討 論

本實驗選用醋酸洋紅與卡寶品紅分別對分裂期相近的花藥染色，發現卡寶品紅染色方法尤其適合本科學生實驗，前人研究使用卡寶品紅染色一般認為需要10～15 min，而且有的研究者主張花藥材料要解離才染色效果好；本研究發現使用卡寶品紅染色時材料上色迅速，大約3～5 min就可將花藥染色，而且花藥材料也不需要預先解離就能很好的染色，值得一提的是用這種方法制片時，不能用整個花藥制片，要把黑麥花藥切分成若干小段，這樣就使得花藥壁里的花粉母細胞散落出來，很容易上色，無需解離。

在揭片方法上本研究發現叔丁醇脫水揭片法在操作過程中極其容易丟失材料，造成觀察的分裂相失真；低溫冷凍揭片法能夠保證材料的完好，利于研究與觀察。有研究者用加熱烘干的方法揭片，本研究對此種方法未進行試驗，在今后的研究中進一步探討。

黑麥為二倍體植物，體細胞有14條染色體，染色體數較少，減數分裂各時期的分裂相易于觀察。而且黑麥花藥比較大，在操作時容易選取，材料不易丟失。減數分裂各個時期動態連續的染色體標本的制作，對于學生正確了解染色體在減數分裂各時期的行為特點具有重要意義。制作良好的染色體標本也可用于后續的分帶、基因定位等研究。

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Study on Experimental Specimen Making of Meiotic Chromosome of Rye

DING Haiyan，ZI Xiaoxue

(Daqing Normal University,Daqing,Heilongjiang 163712,China)

In order to establish a set of techniques for meiotic chromosome specimen making with simple procedures,glass slides for rye chromosomes were prepared by the improved method,using rye anthers as experimental materials,dyed by carbol fuchsin and the acetic acid magenta,and the meiosis of pollen mother cell of rye was observed under microscope and recorded by photograph.Two methods for coverslip removing(by the tertiary butyl alcohol and by freezing) were studied and compared.Specimens stained with carbol fuchsin are full of bright,suitable for undergraduate experimental teaching.Specimens dyed by acetic acid magenta are light red,more suitable for usinginsituhybridization,which will not affect the experimental results.Materials are easy to lose during the coverslip removing by the tertiary butyl alcohol,but the materials are in good condition during coverslip removing by freezing,with simple operation.Results showed that these permanent specimens stained with carbol fuchsin and coverslip removing by freezing were good,showing dynamic continuous phase.These specimens included two stages(meiosis Ⅰ and meiosis Ⅱ of rye) and all are dynamic process.They could be better used in the experimental teaching andinsituhybridization study.

Rye；Meiosis；Chromosome specimen

麥類作物學報 2016，36(12)：1635?1642JournalofTriticeaeCropsdoi：10．7606/j．issn．1009?1041．2016．12．13

時間：2016-12-07

2016-05-16

2016-11-15

大慶師范學院科學研究基金項目(12ZR04) 第一作者E-mail:dinghaiyan2004@126.com

S512.5；Q23

A

1009-1041(2016)12-1629-06

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20161207.1751.024.html