HPLC法測(cè)定烏龍茶中6種兒茶素類成分含量

韋 杰 周璐煒 何金蓮 謝 靜

(成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，成都 610083)

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HPLC法測(cè)定烏龍茶中6種兒茶素類成分含量

韋 杰 周璐煒 何金蓮 謝 靜*

(成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，成都 610083)

采用HPLC外標(biāo)法測(cè)定烏龍茶中沒食子兒茶素(EGC)、兒茶素(C)、表沒食子基兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素(EC)、沒食子基兒茶素沒食子酸酯(GCG)、沒食子酰表兒茶素(ECG)等6種兒茶素類化合物的含量。選用Shimadzu Wonda Cract ODS-2色譜柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為0.5%乙酸水溶液(A相)、乙腈(B相)，梯度洗脫：0～40 min從10% B線性上升至30% B；流速為1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，柱溫為35 ℃。結(jié)果表明5種不同品牌的烏龍茶中EGC、C、EC、EGCG、GCG和ECG的含量分別為19.5～85.3 mg/g、152.9～376.5 mg/g、4.7～19.2 mg/g、39.4～181.9 mg/g、10.0～74.3 mg/g和15.4～64.2 mg/g，本方法可以準(zhǔn)確地測(cè)定烏龍茶中的6個(gè)指標(biāo)成分的含量，為烏龍茶質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

烏龍茶 兒茶素 高效液相色譜法

烏龍茶是中國(guó)六大茶系之一，屬于半發(fā)酵茶，既有綠茶的清香，又有紅茶的濃郁。烏龍茶的藥理作用，不但突出表現(xiàn)在具有分解脂肪、減肥健美的效果[1]，還有緩解心血管疾病、降膽固醇、抗氧化、抗菌、抗癌、降血糖等作用[2-5]。烏龍茶含有多種有機(jī)化學(xué)成分和無(wú)機(jī)礦物元素功效成分，其中最重要、含量最高的是兒茶素類化合物，主要包括表沒食子兒茶素(epigallocatechin，EGC)、兒茶素(catechin，C)、表沒食子基兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)、表兒茶素(epicatechin，EC)、沒食子基兒茶素沒食子酸酯(gallocatechin gallate，GCG)、沒食子酰表兒茶素(epicatechin gallate，ECG)等，這6個(gè)兒茶素類化合物被認(rèn)為是烏龍茶的主要活性成分[6]。目前，尚無(wú)對(duì)這6個(gè)成分進(jìn)行定量分析的報(bào)道，為更全面地評(píng)價(jià)烏龍茶的品質(zhì)，本研究開發(fā)了一個(gè)新的HPLC方法對(duì)烏龍茶中6種兒茶素成分的含量進(jìn)行了定量測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料

超聲波清洗器(KH5200B，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；分析天平(GA110，Ohaus)、移液器(KA0004731：100～1000 μL，KE0040836：10～100 μL)，島津高效液相色譜系統(tǒng)(包含LC-20AD二元高壓泵、DGU-20A3R自動(dòng)脫氣機(jī)、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、MSD-M20A二極管陣列檢測(cè)器)。6個(gè)對(duì)照品表沒食子兒茶素(EGC)、兒茶素(C)、表沒食子基兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素(EC)、沒食子基兒茶素沒食子酸酯(GCG)、沒食子酰表兒茶素(ECG)購(gòu)買于成都普思生物科技股份有限公司，使用娃哈哈純凈水和色譜純乙腈作為洗脫溶劑，其它試劑均為分析純，5個(gè)烏龍茶樣品均為市售商品。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱為Shimadzu Wonda Cract ODS-2(4.6 mm × 250 mm，5 μm)。流動(dòng)相為0.5%乙酸水溶液(A相)、乙腈(B相)，梯度洗脫：0～40 min從10% B線性上升至30% B；流速為1.0 mLmin-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，柱溫為35 ℃。分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，理論塔板數(shù)以兒茶素峰計(jì)不低于12000。

1.2.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備

分別取一定量的EGC、C、EGCG、EC、GCG、ECG購(gòu)對(duì)照品，精密稱量，用50%甲醇溶解配成相應(yīng)的對(duì)照品儲(chǔ)備液：EGC 6.2 mg/mL、C 5.1 mg/mL、EC 9.5 mg/mL、EGCG 4.9 mg/mL、GCG 4.9 mg/mL、ECG4.7 mg/mL，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 樣品溶液的制備

取60 mg烏龍茶粉末，精密稱量，至25 mL容量瓶中，加50%甲醇超聲提取15 min，重復(fù)一次，合并提取液，定溶至50 mL，搖勻，0.45 μm濾過，即得。

1.2.4 線性關(guān)系

將對(duì)照品儲(chǔ)備液按照25∶15∶6∶30∶8∶15的比例混合，得到混標(biāo)工作溶液I，將其逐級(jí)稀釋得到混標(biāo)工作溶液Ⅱ～Ⅴ。分別吸取混標(biāo)工作溶液I～Ⅴ10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一烏龍茶粉末6份，精密稱量，分別按照“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按照“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.6 回收試驗(yàn)

取同一烏龍茶粉末9份，精密稱量，分為3組，每組緊密加入相當(dāng)于已知含量50%、100%和150%的對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別按照“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按照“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定含量，計(jì)算加樣回收率。

1.2.7 樣品測(cè)定

分別取不同品牌的烏龍茶樣品，按照“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，將供試品溶液注入色譜儀，記錄色譜圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 分析條件的選擇

本試驗(yàn)比較了多種溶劑洗脫系統(tǒng)，包括乙腈-水、甲醇-水、乙腈-酸性水溶液、甲醇-酸性水溶液，結(jié)果表明甲醇系統(tǒng)的基線漂移較為顯著，而酸性水溶液的使用可以避免色譜峰拖尾，提高對(duì)稱性，因此最終采用乙腈-0.5%乙酸水溶液作為流動(dòng)相。對(duì)于檢測(cè)波長(zhǎng)選擇，210 nm處色譜圖的基線漂移非常嚴(yán)重；而對(duì)樣品在200～400 nm全掃描，可發(fā)現(xiàn)EGCG、GCG和ECG在280 nm處有一個(gè)明顯的強(qiáng)吸收，如圖1所示。

雖然EGC、C、EC在280 nm的吸收強(qiáng)度不如250 nm處，但是考慮到280 nm處的基線更加平穩(wěn)，因此選擇280 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。本試驗(yàn)嘗試了不同的柱溫(20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃)和不同的流速(0.8 mLmin-1、1.0 mLmin-1、1.2 mLmin-1、1.4 mLmin-1)對(duì)分離的影響，結(jié)果表明，柱溫和流速雖然會(huì)使色譜峰整體移動(dòng)，但對(duì)色譜峰的峰形和分離度影響不大，綜合考慮，最終選擇35 ℃作為柱溫，流速為1.0 mLmin-1。綜合上述篩選，確定色譜條件，對(duì)照品和樣品色譜圖如圖2所示。

2.2 方法學(xué)考察結(jié)果

結(jié)果表明，6個(gè)兒茶素類對(duì)照品線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為：EGCy= 6164824x- 86223,r2=0.9992；Cy= 2390074x+ 33789,r2=0.9995；ECy= 5080708x+ 5066,r2=0.9995；EGCGy= 6161781x- 83967,r2 =0.9993；GCGy= 4750767x- 4905,r2=0.9994；ECGy= 5545450x+ 2810,r2 =0.9998；對(duì)同一烏龍茶的6份樣品重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明重復(fù)性良好，EGC、C、EC、EGCG、GCG和ECG的RSD分別為：2.28%、1.02%、1.62%、1.42%、1.95%和0.91%；對(duì)同一烏龍茶的9份樣品進(jìn)行加樣回收實(shí)驗(yàn)，EGC、C、EC、EGCG、GCG和ECG的平均回收率(n=9)分別為：99.06% (RSD=2.84%)、99.08% (RSD=1.68%)、99.32% (RSD=1.96%)、99.20% (RSD=2.04%)、99.49% (RSD=2.19%)、99.29% (RSD=1.88%)。方法學(xué)考察結(jié)果說明本方法滿足定量分析的要求，準(zhǔn)確可靠，可以用于烏龍茶樣品中兒茶素類化合物的含量測(cè)定。

2.3 樣品測(cè)定結(jié)果

按外標(biāo)法計(jì)算樣品中兒茶素的含量(表1)，所測(cè)定的5種不同品牌的烏龍茶中EGC、C、EC、EGCG、GCG和ECG的含量分別為19.5～85.3 mg/g、152.9～376.5 mg/g、4.7～19.2 mg/g、39.4～181.9 mg/g、10.0～74.3 mg/g和15.4～64.2 mg/g。通過對(duì)烏龍茶中6種指標(biāo)成分的準(zhǔn)確定量，分析各批樣品成分含量差別，可為烏龍茶質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

表1 不同烏龍茶樣品中兒茶素含量測(cè)定結(jié)果 mg/g

[1] Zhu J C, Chen F, Wang L Y, et al. J Agri Food Chem, 2015, 63(34): 7499-7510.

[2] Hosoda K, Wang M F, Liao M L, et al. Diabetes Care, 2003, 26(6): 1714-1718.

[3] Zhang X, Wu Z F, Weng P F. J Agri Food Chem, 2014, 62(41): 10046-10054.

[4] Zhu Q Y, Hackman R M,Ensunsa J L,et al. J Agri Food Chem, 2002, 50(23): 6929-6934.

[5] 藍(lán)雪銘, 劉志彬, 倪莉. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2014, 14(2): 201-207.

[6] Chen Y L, Duan J, Jiang Y M, et al. Food Rev Int, 2010. 27(1): 1-15.

Simultaneous determination of six catechins in Oolong by HPLC.

Wei Jie, Zhou Luwei, He Jinlian, Xie Jing

*(SchoolofPharmacy,ChegnduMedicalCollege,Chengdu610083,China)

HPLC separation was performed on a Shimadzu Wonda Cract ODS-2 analytical column (250 mm×4.6 mm, 5 μm). with a flow rate of 1.0 mL·min-1. while the column temerature was 35 ℃. The mobile phase consisted of water containing 0.5% acitic acid (A) and acetonitrile (B) with a linear gradient elution of 10%-30% B for 40 min. The detection wavelength was 280 nm. The contents of EGC, C, EC, EGCG, GCG and ECG were 19.5-85.3 mg/g, 152.9-376.5 mg/g, 4.7-19.2 mg/g, 39.4-181.9 mg/g, 10.0-74.3 mg/g and 15.4-64.2 mg/g, respectively.

Oolong; catechins; HPLC

四川省2015大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(No. 201513705078)，四川省教育廳科研計(jì)劃(No. 16ZA0299)

韋杰，男，1994年出生，本科生。

謝靜，女，1979年出生，博士，講師，主要從事天然產(chǎn)物活性成分研究，Email: aggie-xj@163.com。

10.3936/j.issn.1001-232x.2016.06.012

2016-05-15