提取溶劑對青稞提取物總酚、黃酮含量及其抗氧化活性的影響

申迎賓

張友維2

黃才歡1

陳永生1

王 立3

歐仕益1

張 暉3

(1. 暨南大學理工學院食品科學與工程系，廣東 廣州 510632；2. 江蘇食品藥品職業技術學院，江蘇 淮安 223003；3. 江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；4. 江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

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提取溶劑對青稞提取物總酚、黃酮含量及其抗氧化活性的影響

申迎賓1

張友維2

黃才歡1

陳永生1

王 立3

歐仕益1

張 暉3

(1. 暨南大學理工學院食品科學與工程系，廣東 廣州 510632；2. 江蘇食品藥品職業技術學院，江蘇 淮安 223003；3. 江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；4. 江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

以3種不同的青稞為原料，采用不同的提取溶劑(水、60%乙醇、60%甲醇、60%丙酮、95%乙醇、100%甲醇、100%丙酮)對青稞進行提取。對各提取物的總酚、總黃酮進行測定，同時采用3種抗氧化方法：二苯代苦味酰自由基(DPPH)、2，2’-聯氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽自由基(ABTS)和總抗氧化能力(FARP)評價青稞提取物的抗氧化活性。結果表明，95%乙醇和60%丙酮更有利于青稞多酚的提取。藏青2000的各溶劑提取物的總酚、總黃酮及抗氧化活性普遍高于相應溶劑的循化藍青稞和香格里拉綠青稞。藏青2000的60%丙酮提取物含有最高的總酚含量，達到211.92 mg GAE/100 g DW；在60%乙醇提取時具有最高的總黃酮含量，達到60.11 mg RT/100 g DW；在60%乙醇提取時具有最強的DPPH清除能力，達到80.08%；而用60%丙酮提取時，具有最強的ABTS清除能力和總抗氧化能力，分別達到了1.85，9.28 mmol TEAC/100 g DW。總酚含量與抗氧化活性均具有顯著的相關性，FRAP法與DPPH、ABTS法具有極顯著的相關性。綜上表明，青稞富含總酚成分，是一種潛在的天然抗氧化劑資源。

青稞；總酚；總黃酮；抗氧化；DPPH；ABTS；FRAP

流行病學研究[1-3]表明，全谷物與氧化應激相關的慢性病有著密切關系，在一定程度上有助于緩和慢性病的發展。其機制可能與全谷物中的多酚類成分有關[4-5]，因此谷物的抗氧化活性開始被廣大學者重視。

隨著人們對全谷物的認識和不斷的推廣，谷物多酚被認為是全谷物發揮作用的主要物質基礎。青稞由于其生長在高海拔、高寒、缺氧、強光照的極端環境下，因此和其他谷物不同，是一種高蛋白、高纖維、低脂肪、低糖的谷物資源，這符合現代人“三高兩低”的飲食結構。以往研究多偏向于青稞花色苷的研究[6-7]，而對青稞總多酚和黃酮的研究較少[8-9]，但是有關溶劑對其多酚含量的影響報道也較少[10]，Zhao等[10]研究比較了水、80%乙醇、80%甲醇、80%丙酮4種提取溶劑對大麥多酚及抗氧化活性的影響，認為80%丙酮適合大麥多酚成分的提取，但沒有考慮溶劑對總黃酮的影響。張海暉等[11]研究了70%乙醇、70%甲醇和70%丙酮對米糠、高粱、甜高粱、大麥、水稻、燕麥等谷物的多酚含量及抗氧化活性的影響，認為70%乙醇更有利于多酚化合物的提取，但沒有研究高濃度的有機溶劑對多酚含量的影響，也沒有考察其對總黃酮含量的影響。因此，本試驗選擇3種青稞為原料，較為系統的研究不同的提取溶劑對青稞總酚、總黃酮含量和抗氧化活性(DPPH、ABTS、FARP)的影響；分析青稞總酚、總黃銅與抗氧化活性的相關性及抗氧化方法間的相關性，為其功能產品的開發提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藏青2000：產地西藏日喀則，迪慶香格里拉青稞資源開發有限公司；

循化藍青稞、香格里拉綠青稞：彩云之南美食坊；

福林酚試劑：2 mol/L，上海荔達生物科技有限公司；

對二苯代苦味酰自由基(DPPH)、3-吡啶三吖嗪(TPTZ)、2，2’-聯氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)和水溶性維生素E衍生物(Trolox)：分析純，美國Sigma 公司；

沒食子酸、蘆丁：純度>99.98%，北京百靈威科技有限公司；

高速中藥粉碎機：DFY-500型，浙江溫嶺市林大機械有限公司；

水浴恒溫振蕩器：SHZ-B型，上海市實驗儀器廠；

電熱鼓風干燥箱：GZX-QF101-3S型，上海躍進醫療器械廠；

可見分光光度計：722N型，上海精密科學儀器有限公司；

精密電子天平：FA100，上海上平儀器公司；

離心機：L550型，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取工藝流程 青稞用粉碎機整粒磨碎，過60目篩，備用。準確稱量1.0 g各青稞粉末，用25 mL相應提取溶劑在60 ℃下，震蕩提取2 h， 重復2次，旋轉濃縮，采用60%乙醇定容25 mL，青稞提取物濃度為40 mg青稞谷物/mL，-20 ℃保存待測。

1.2.2 總酚含量的測定 采用福林酚法[12]。取0.5 mL青稞提取物樣品，加入0.5 mL福林酚試劑和2 mL 15%的碳酸鈉溶液，充分混合，定容至10 mL，然后混勻，室溫下反應60 min，以不加碳酸鈉溶液的反應液為空白，在特征吸收波長765 nm處測定吸光度值，記錄數據，根據沒食子酸標準曲線的線性方程：Y=0.089 3X+0.129 5(R2=0.997 8)計算樣品總酚的相對含量。以mg GAE/100 g DW計算。

1.2.3 總黃酮的測定 根據NY/T 1295—2007標準，配制不同濃度的蘆丁標準溶液0.000，0.025，0.050，0.100，0.150，0.200 mg/mL，取各標準液1 mL，加入0.1 mol/L三氯化鋁(AlCl3·6H2O)2 mL，加入乙酸鉀1.5 mL， 加入相應溶劑0.5 mL，室溫放置30 min，以試劑溶劑為參比溶液，在420 nm處測定吸光度。以吸光度和蘆丁濃度繪制標準曲線，樣品測定時，取樣品液1 mL，按照上述操作進行試驗，根據線性方程Y=11.828X+0.045 1(R2=0.994 1)測定樣品中的總黃酮含量，表示為mg Rutin/100 g DW。

1.2.4 DPPH自由基清除能力測定 根據文獻[13～14]并做一定修改。稱量一定質量的DPPH，以乙醇為溶劑，制濃度為2 ×10-4mol /L 的DPPH溶液，保存于4 ℃冰箱中，備用。在4 mL 2×10-4mol/L DPPH 溶液中加入0.5 mL青稞提取液樣品，搖勻，然后在室溫下放置30 min，在517 nm下測定其吸光值Ai；同時測定4 mL 2×10-4mo1/L DPPH·溶于0.5 mL的60%乙醇混合液的吸光值AC；根據式(1)計算青稞樣品對DPPH的抑制率。

(1)

式中：

S——DPPH的抑制率，%；

Ai——加樣品時DPPH·溶液的吸光值；

AC——未加樣品時DPPH·溶液的吸光值。

1.2.5 ABTS自由基的測定 根據文獻[10]并做一定修改，取4.9 mL ABTS+溶液與0.1 mL青稞提取液混合，反應10 min，測定734 nm下吸光度，空白為0.1 mL 相應提取溶劑。以Trolox為參照，制作標準曲線，根據線性方程Y=0.815 1X+0.007 6(R2=0.998 5)，計算對ABST自由基的清除效果，計算結果以mmol TEAC/100 g DW表示。

1.2.6 總抗氧化能力測定 根據文獻[15]并做相應修改：取4 mL的FRAP試劑與0.1 mL青稞提取物樣品，混勻，反應10 min， 然后在593 nm下測吸光值。以不同濃度梯度的Trolox溶液為標樣作標準曲線，總抗氧化能力用TEAC (水溶性維生素E抗氧化當量，trolox equivalent antioxidant capacity)表示，空白0.1 mL相應提取溶劑，得到吸光值(Y)與Trolox 含量(x)之間的回歸方程Y=0.672 6X+0.226 6(R2=0.995 9)。

1.3 數據處理與分析

采用Excel 2003和SPSS17.0軟件進行數據處理，結果以均值±標準偏差表示。

2 結果與討論

2.1 提取溶劑對青稞提取物總酚含量的影響

研究[1, 16-17]表明，谷物中富含多酚成分，是一種潛在的天然抗氧化劑資源。溶劑對青稞提取物總酚含量的影響見表1。由表1可知，藏青2000和香格里拉綠青稞均在60%丙酮提取時，具有最高的總酚含量，分別達到了211.92，180.36 mg GAE/100 g DW，是其相應水提取物的1.35，2.65倍。而循化藍青稞在95%乙醇提取時，總酚含量最高，達到了169.84 mg GAE/100 g DW，是其水提取物的1.69倍。除60%丙酮和95%乙醇外，在使用相同的提取溶劑時，藏青2000的總酚含量最高，循化藍青稞次之，而香格里拉綠青稞最低。綜上表明，在提取青稞總酚時，可以選擇60%的丙酮或者95%的乙醇作為提取溶劑。

表1 溶劑對青稞提取物總酚含量的影響

Table 1 Effect of different extraction solvents on total phenolic contents of highland barley

mg GAE/100 g DW

2.2 提取溶劑對青稞提取物總黃酮含量的影響

溶劑對青稞提取物總黃酮含量的影響見表2。由表2可知，藏青2000和循化藍青稞均在60%乙醇提取時，具有最高的總黃酮含量，分別達到了60.11，45.06 mg RT/100 g DW，是其相應水提取物的1.36，1.28倍。而香格里拉綠青稞在60%的甲醇提取時具有最高的總黃酮含量，達到了52.99 mg RT/100 g DW，是其水提取物的1.39倍。在使用相同提取溶劑時，藏青2000的總黃酮含量均較循化藍青稞和香格里拉綠青稞高。綜上表明，在提取青稞總黃酮時，60%乙醇和60%甲醇可以作為提取溶劑。

2.3 DPPH自由基清除能力

溶劑對青稞提取物清除DPPH自由基能力的影響見表3。由表3可知，3種青稞均在60%乙醇提取時，DPPH清除能力達到最高，分別達到了80.08%，72.66%，50.32%，是其相應水提取物的近13，57，22倍。同時，青稞的相同溶劑提取物(除水外)的DPPH自由基清除能力普遍是藏青2000最高，循化藍青稞次之，香格里拉綠青稞最低。總體來看，如果以DPPH清除能力為衡量指標，則60%乙醇更適合作為青稞的提取溶劑。

表2 溶劑對青稞提取物總黃酮含量的影響

Table 2 Effect of different extraction solvents on total flavonoid contents of highland barley

mg RT/100 g DW

表3 溶劑對青稞提取物清除DPPH自由基能力的影響

Table 3 Effect of different extraction solvents on DPPH radical scavenging ability of highland barley

%

2.4 ABTS自由基清除能力

溶劑對青稞提取物清除ABTS自由基能力的影響見表4。由表4可知，3種青稞均在60%丙酮提取時，ABTS自由基清除能力達到最高，分別為1.85，1.71，1.55 mmol TEAC/100 g DW，分別為相應水提取物的1.40，1.78，2.82倍。在使用相同提取溶劑提取時，藏青2000含量最高，循化藍青稞次之，香格里拉綠青稞最低(60%乙醇除外)。在相同提取溶劑時，藏青2000的ABTS自由基清除能力較其他兩種青稞強。這表明，如果以ABTS自由基清除能力為衡量指標，則60%丙酮更適合作為青稞的提取溶劑。

2.5 總抗氧化能力

溶劑對青稞提取物總抗氧化能力的影響見表5。由表5可知，3種青稞均在60%丙酮提取時，總抗氧化能力達到最高，分別為9.28，7.91，3.86 mmol TEAC/100 g DW，分別為相應水提取物的3.22，4.10，3.11倍。這說明60%丙酮有利于青稞高抗氧化活性物質的提取。在采用相同提取溶劑時，藏青2000的總氧化能力均較其他兩種青稞強。

2.6 相關性分析

由表6可知，總酚與DPPH自由基清除率的相關系數為0.48，達到了顯著水平。與ABTS和FRAP兩種方法的相關系數為0.617和0.597，并達到了極顯著水平，這說明總酚與體外抗氧化活性密切相關，同時也表明存在其他成分對抗氧化活性的貢獻。青稞中的總黃酮與抗氧化活性沒有相關性。DPPH和FRAP相關性較高(0.611)，且達到了極顯著水平，ABTS與FRAP兩種方法的相關性較高(0.695)，也達到了極顯著水平，說明FRAP與DPPH、ABTS具有一定的同質性，這表明，在評估青稞抗氧化活性的時候，可以選擇DPPH、ABTS兩種方法，FRAP則可以不列入選項，同時，為了更好的評估青稞的抗氧化活性，可以再采用不同機理的抗氧化評價方法，從不同側面來反應青稞抗氧化活性的水平。

表4 溶劑對青稞提取物清除ABTS自由基能力的影響

Table 4 Effect of different extraction solvents on ABTS radical scavenging ability of highland barley

mmol TEAC/100 g DW

表5 溶劑對青稞提取物總抗氧化能力的影響

Table 5 Effect of different extraction solvents on total antioxidant activity of highland barley

mmol TEAC/100 g DW

表6 青稞總酚和總黃酮與抗氧化方法的相關性?

Table 6 Pearson’s Correlation among TPC，TFC and antioxidant methods

檢測指標總酚總黃酮DPPHABTS總黃酮0.365DPPH0.480*0.345ABTS0.617**0.3170.412FARP0.597**0.0030.611**0.695**

? *代表顯著(P<0.05)，**代表極顯著(P<0.01)。

3 結論

任何一種溶劑均不可能將谷物中的所有抗氧化成分提取出來，考慮到谷物中的主要抗氧化成分是多酚類化合物，在水、乙醇、甲醇和丙酮中溶解度較高。本試驗選擇水、乙醇、甲醇、丙酮作為溶劑，重點考察中、高濃度溶劑對青稞總酚、總黃酮及抗氧化活性的影響。結果表明，中濃度的有機溶劑更有利于總酚成分的溶出，且節約了成本。但本研究沒有考察多酚的具體成分，也沒有從生物吸收代謝角度考察多酚攝入后的抗氧化活性情況，將在后續研究中加以完善。同時，由于FRAP法與DPPH和ABTS法具有顯著的相關性，所以在以后的評價試驗中可以簡化青稞體外抗氧化活性評價方法。

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Effect of different solvents on total phenolic content, total flavonoid content and antioxidant activity of highland barley

SHNE Ying-bin1

ZHANGYou-wei2

HUANGCai-huan1

CHENYong-sheng1

WANGLi3,4

OUShi-yi1

ZHANGHui3,4

(1.DepartmentofFoodScienceandEngineering,JinanUniversity,Guangzhou,Guangdong510632,China;2.JiangsuFood&PharmaceuticalScienceCoollege,Huai′an,Jiangsu223003,China;3.ChinaStateKeyLaboratoryofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China;4.SchoolofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China)

The objectives of this study were to evaluate total phenolic, total flavonoid content and antioxidant activities of different extraction from three kinds of highland barley. The results showed that 95% ethanol and 60%acetone were better to extract phenolic compounds than other solvents. Total phenolic and total flavonoid contents, antioxidant activities of Zangqing 2000 using different solvents were higher than that of Xunhua and Shangri-la highland barley. Meanwhile, the highest total phenolic content of Zangqing 2000 was 211.92 mg GAE/100 g DW in 60% acetone, the highest total flavonoid content of Zangqing 2000 was 60.11 mg RT/100 g DW in 60% ethanol, the highest ABTS scavenging ability and total antioxidant activity of Zangqing 2000 were 1.85 and 9.28 mmol TEAC/100 g DW, respectively. Furthermore, there was a significant correlation between total phenolic content and antioxidant methods. FRAP method was significantly correlated to DPPH and ABTS methods. These results suggested that highland barley was rich in phenolic content and considered as a good natural antioxidant resource.

highland barley; total phenolic content; total flavonoid content; antioxidant activity; DPPH; ABTS; FRAP

中國博士后科學基金(編號：2016M602605)；廣東省自然科學基金(編號：32215105)；江蘇省自然科學基金(編號：BK20130410); “十二五”科技支撐計劃(編號：2012BAD37B08-3)；863計劃(編號：2013AA102203-7)；國家自然科學基金(編號：31471617)

申迎賓，男，暨南大學在讀博士后。

張暉(1967-)，女，江南大學教授。 E-mail: zhanghuigwzx@gmail.com

2015—08—31

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.11.030