適合牛肉嫰化的微生物菌株的分離、篩選與鑒定

譚 雅

李宗軍

李 珂

吳根梁

(湖南農業大學，湖南 長沙 410128)

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適合牛肉嫰化的微生物菌株的分離、篩選與鑒定

譚 雅

李宗軍

李 珂

吳根梁

(湖南農業大學，湖南 長沙 410128)

為篩選得到適合嫩化牛肉的優良菌株，從貴州傳統豆豉和甜酒曲分離得到產蛋白酶的細菌22株；以酶活值為主要指標，牛肉的質構特性為參考指標，對菌株進行復篩，最終確定D7為最優菌株，酶活達71.68 U/g。結合16S rDNA序列鑒定及系統發育樹分析，對目的菌株進行分子生物學鑒定。結果表明：D7與解淀粉芽孢桿菌(JN700123.1)最為接近，相似度達99%，該菌株鑒定為解淀粉芽孢桿菌。

蛋白酶；酶活；解淀粉芽孢桿菌；質地剖面分析(TPA)；16S rDNA

隨著人們肉食結構的改變和生活水平的不斷提高，牛肉越來越受到消費者的青睞，而牛肉的嫩度是影響消費者評定牛肉質量最重要的一個因素[1]，所以肉類嫩化的相關研究逐漸成為人們關注的熱點之一。在中國部分役用牛、水牛和山區放養的老齡黃牛也被適時地作為肉用，這類牛肉的質構特性相對較差，但對中國肉食結構的改善是重要的補充。特別是在欠發達地區和中檔以下的餐廳具有較大的市場，采取科學、有效、安全的技術措施，改善這類牛肉的品質，具有重要的現實意義。牛肉嫩化的方法主要包括電刺激法[2]、機械嫩化法[3]、高壓嫩化法[4]、超聲波嫩化法[5]、外源酶嫩化法[6]等，從目前效果來看，外源性蛋白酶技術可使牛肉柔軟且易于咀嚼，能很好地提高牛肉的品質。但是目前市場上，嫩肉粉魚龍混雜，產品質量不一，組成成分各異，存在一定的安全隱患，動植物來源的蛋白酶由于受到原料的限制，實際應用因成本問題而有一定的困難。微生物源的單一蛋白酶對于肉品的嫩化效果不一，難以實現標準化控制。而隨著肉品加工業的不斷發展，特別是肉類中式菜肴的工業化生產，希望有安全、高效、可控的優質肉類嫩化劑來保障菜肴工業化生產過程中的標準化。生物型嫩化劑是通過篩選特定的微生物，采用現代發酵工程技術手段，獲得由多種蛋白酶組成的復合型酶制劑，在理論上可以對牛肉中的不同蛋白質進行可控的降解，從而提高牛肉的嫩度，改善牛肉的風味及加工品質，目前還鮮見文獻報道。

本試驗擬從貴州傳統豆豉和甜酒曲中分離篩選出產蛋白酶的細菌菌株，在特定條件下培養后，用發酵液處理黃牛肉后，經質構特性分析，篩選出適合嫩化牛肉的優良菌株，為開發生物型牛肉嫰化劑提供優質的具有自主知識產權的微生物資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

豆豉：產自貴州省鎮遠縣；

甜酒曲：貴州省玉屏縣城關酒曲廠。

1.1.2 培養基

分離培養基：蛋白胨10 g、葡萄糖1 g、氯化鈉5 g、氯化鈣0.1 g、L-酪氨酸0.1 g、瓊脂15 g、酪素5 g、蒸餾水1 000 mL、pH值7.2～7.4，112 ℃滅菌30 min；

發酵培養基：葡萄糖10 g、酵母膏2 g、蛋白胨0.2 g、氯化鈉2 g、氯化鈣2 g、磷酸氫二鉀5 g、磷酸二氫鉀1.25 g、硫酸鎂0.01 g、硫酸鐵0.001 g、蒸餾水1 000 mL、pH值7.0,121 ℃下滅菌20 min；

酪蛋白瓊脂培養基：酪蛋白10 g、氯化鈉5 g、磷酸氫二鈉2 g、瓊脂15 g、牛肉膏3 g、蒸餾水1 000 mL、0.4%溴麝香草酚藍溶液12.5 mL、pH 7.4、121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑藥品

DNA Marker、細菌提取試劑盒：北京鼎國昌盛生物技術有限公司；

PCR相關試劑：美國Genview公司；

其他試劑為國產分析純。

1.1.4 設備與儀器

恒溫培養箱：SPX-250B5-II型，上海新苗醫療器械制造有限公司；

搖床：SKY-2102C型，上海百典儀器設備有限公司；

顯微鏡：OLYMPUS型，北京瑞科中儀科技有限公司；

冷凍離心機：TGL-20M型，長沙英泰儀器有限公司；

無菌操作臺：SW-CJ-1FD型，蘇州江東精密儀器有限公司；

紫外分光光度計：BlueStar型，北京萊伯泰科儀器有限公司；

PCR儀：BIO-RAD型，深圳市宇德立生物科技有限公司；

電泳儀：DYCP-33B型，北京六一儀器廠；

質構儀：TA-XT.Plus型，北京微訊超技儀器技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 目的菌株的初篩 準確稱取待分離食品樣品各10 g，放入盛有90 mL無菌生理鹽水并帶玻璃珠的250 mL三角瓶中，振搖約20 min，使微生物細胞分散，靜置20～30 s，即成10-1稀釋液。取上述稀釋液用無菌生理鹽水梯度稀釋成10-2～10-76個梯度，豆豉取10-5～10-7，甜酒曲取10-3～10-5進行平板涂布分離，每個梯度3個平行；涂布量0.1 mL，所得樣品于37 ℃恒溫培養24～48 h。

1.2.2 目的菌株的復篩 取初篩得到的菌株接種至5 mL液體發酵培養基中，37 ℃下220 r/min搖床培養40 h，10 000 r/min離心10 min，取上清液，以0.5 cm直徑圓形濾紙片蘸上清液貼于酪蛋白平板中，于37 ℃恒溫培養24 h后，用量尺測量透明圈的直徑與菌落的直徑，根據平板上透明圈直徑和菌落直徑比值(H/C)的大小，篩選出產生較大水解圈的菌株。

1.2.3 產蛋白酶菌株發酵試驗 將篩選菌株接種至5 mL的牛肉膏蛋白胨液體培養基中，37 ℃下220 r/min搖床培養12～16 h，按5%接種量接種至50 mL的液體發酵培養基中，37 ℃下220 r/min搖床培養48 h，10 000 r/min離心10 min，取上清液測蛋白酶活力。

酶活力測定按GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》的福林法執行。

1.2.4 牛肉TPA質構特性的測定 將酶活力較大的菌株活化，以5%的量接種于50 mL滅菌發酵培養基中，37 ℃下220 r/min搖床培養48 h，5 000 r/min離心3 min，則上清液為粗酶液。取牛肩胛肉，切成2 cm的正方體，分裝到蒸煮袋中，在25 ℃的水浴鍋中將酶液倒入蒸煮袋對牛肉進行浸漬，50 min后將樣品置于80 ℃水浴鍋中加熱，待中心溫度達到70 ℃后取出，冷卻樣品至4 ℃后，采用物性測試儀測定酶液浸漬后牛肉的質構特性[7]，測定樣品的硬度、彈性、凝聚性、膠著性、咀嚼性和回復性，測試完成后，采用spss18.0分析結果。參數[8]設定有一定調整，如下：探頭P/36R；測前2.00 mm/s，測中1.00 mm/s，測后2.00 mm/s，壓縮比50%，每組6個平行。

1.2.5 菌株的鑒定

(1) 形態學觀察：觀察菌株在平板和斜面上的培養特征，同時進行革蘭氏染色[9]，光學顯微鏡放大1 000倍觀察個體形態，進行初步鑒定。

(2) 總DNA的提取：采用溶菌酶破壁[10]和細菌DNA提取試劑盒結合的方法提取目的菌株總DNA。具體如下：取菌液0.6～3.0 mL，12 000 r/min離心1 min棄上清，加入1～2 mL的濃度為5 mg/mL的溶菌酶溶液，37 ℃的水浴鍋酶解破壁，酶解2 h左右，離心棄上清；加入600 μL Lysis Buffer A，漩渦重懸，加入20 μL Proteinase K 60 ℃水浴45～60 min，其間顛倒混勻數次；加入400 μL Lysis Buffer B 充分混勻；10 000 r/min離心10 min，將上清液倒入離心柱中，12 000 r/min離心1 min，棄廢液；加入700 μL Wash buffer A(使用前檢查是否已加入無水乙醇)，12 000 r/min離心1 min，棄廢液；加入700 μL Wash buffer B，12 000 r/min離心1 min，棄廢液；加入500 μL Wash buffer B，12 000 r/min離心1 min，棄廢液；再次12 000 r/min離心2 min，將離心柱置于新的離心管中，并打開離心柱蓋，于室溫或37 ℃恒溫箱放置5～10 min，直至無明顯乙醇味；在硅基質膜中加入50～200 μL TE buffer(事先預熱在55～65 ℃水浴鍋中)，置于室溫2 min，12 000 r/min離心2 min，管底即為基因組。

(3) PCR擴增及序列測定：反應體系(25 μL)：10×PCR buffer(含25 mmol/L Mg2+)2.5 μL，dNTPs(10 μmol/L)0.5 μL，引物(20 μmol/L)各1 μL，Taq(2 U/μL)0.5 μL，DNA模板0.5 μL，ddH2O 19 μL。反應參數：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性50 s；53.5 ℃退火1 min；72 ℃延伸90 s；體系運行30個循環后72 ℃延伸5 min 30 s。將PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至上海生工生物技術有限公司測序。

(4) 序列分析：將測序獲得的序列于NCBI中利用Blast軟件進行比對分析后，利用Lasergene軟件構建目的菌株的系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 菌種的分離、純化與篩選

挑取出能產生水解圈的菌株，經分離和純化共得到豆豉12株、甜酒曲10株，將這22株菌接種于酪蛋白平板中，其水解圈的比值見表1。將水解圈直徑和菌落直徑比值大于3的菌株進行蛋白酶活力的測定，由表1可知，分別選出豆豉(D5、D7、D9、D11、D12)和甜酒曲(J1、J3、J5、J6、J9)進行下一級篩選。

2.2 蛋白酶活力的測定

2.2.1 酪氨酸標準曲線圖(圖1) 根據標準曲線的各點，添加趨勢線后得出回歸方程y=0.010 8x-0.076 8，利用回歸方程，計算出當吸光度為1時的酪氨酸的量(μg)，即吸光常數K值為99.7，利用K值，計算出酶活力值。

表1 透明圈與菌落直徑比值(H/C)表Table 1 The ratio of hydrolytic zone and colony area(H/C)

圖1 酪氨酸標準曲線圖Figure 1 The standard curve of L-tyrosine

2.2.2 蛋白酶活力值 由表2可知，10株菌中，通過縱向比較，發現蛋白酶活力較大的菌分別是豆豉中的D7、D11和甜酒曲中的J5、J9，分別達到71.68，66.75，71.39，54.56 U/g。因此選取這4株菌對牛肉進行浸漬，并測定其質構特性。

表2 菌的蛋白酶活力值Table 2 The protease activity value of strain

2.3 不同菌株產蛋白酶對牛肉的質構特性

經試驗得出，4種菌均能使牛肉的質構特性得以改善，見表3。其中菌D11處理組的硬度、膠著性和咀嚼性相對于空白組分別降低了8.5%，12.5%，13.8%；菌J9處理組硬度、膠著性和咀嚼性分別降低了19.3%，20.44%，29.4%；菌J5處理組硬度、膠著性和咀嚼性分別降低了23.4%，24.5%，25.12%；菌D7處理組硬度、膠著性和咀嚼性分別降低了31.37%，31.8%，38.2%；通過這4株菌處理后的牛肉在硬度、膠著性和咀嚼性中相對于空白組K顯著下降，變化均差異顯著(P<0.05)，這就表明酶液對牛肉的質構特性有一定的影響，但是在彈性、凝聚性和回復性中無明顯變化。通過4株菌處理后的牛肉硬度值從大到小的順序是D7、J5、J9、D11，膠著性從大到小的順序是D7、J5、J9、D11，咀嚼性從大到小的順序是D7、J9、J5、D11。綜合以上分析，菌D7對牛肉的嫩化效果最為突出，則確定D7為最佳的對牛肉嫩化的菌株，并進行分子學鑒定。

2.4 D7的鑒定結果與分析

2.4.1 形態學觀察結果與分析 觀察D7在平板和斜面上的培養特征，菌株在分離培養基平板上37 ℃培養(24±2) h呈白色，光滑濕潤菌落，稍隆起，菌落中間有褶皺，在分離培養基斜面上呈薄膜狀，表面白色，見圖2。同時對D7進行革蘭氏染色，光學顯微鏡放大1 000倍觀察個體形態，為革蘭氏陽性、有芽孢的桿狀菌，見圖3。但是并不能得出D7的種屬信息，因此需進一步做分子生物學鑒定。

表3 不同菌株處理后質構特性的變化?Table 3 The different strains after processing quality and structure features of change

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

圖2 細菌D7平板和斜面培養特征Figure 2 Bacterial characteristics in plate and slant culture

圖3 D7革蘭氏染色圖Figure 3 Gram stain picture of D7

2.4.2 分子生物學鑒定結果與分析 以溶菌酶破壁和細菌提取試劑盒相結合的方法提取細菌D7基因組DNA，27F/1492R為引物擴增細菌D7的ID區，擴增產物用瓊脂糖電泳檢測，條帶清晰(見圖4)，擴增的片段長度在1 500 bp左右。

將回收好的細菌PCR產物送至上海生工生物技術有限責任公司檢測基因序列，得到細菌準確的序列在NCBI上進行BLAST比對，得出細菌D7與解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)序列相似性達99%，最后采用Lasergene軟件構建目的菌株D7的系統發育樹，見圖5。

3 結論

本試驗對產蛋白酶菌株的來源進行了一個比較全面、細致的篩選，分離鑒定出能嫩化牛肉的優勢菌株D7。該菌的酶活力值、對牛肉嫩化的效果相對于空白組都較好。經16S rDNA測序及系統發育樹分析，鑒定菌株D7為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，但有關該菌的安全性及發酵工藝特性，還需要進一步的研究，隨著研究的深入，該產品將具有廣泛的應用前景。

圖4 細菌D7 16s rDNA電泳圖Figure 4 16s rDNA electrophoretogram of bacteria D7

圖5 D7解淀粉芽孢桿菌的16S rDNA系統發育進化樹Figure 5 Phylogentic tree of Bacillus amyloliquefaciensD7 based on 16S rDNA 參考文獻

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Separation, screening and identification of special microbial strain for beef meat tenderizer

TAN Ya

LIZong-jun

LIKe

WUGen-liang

(HunanAgriculturalUniversity,Changsha,Hunan410128,China)

In order to obtain microbial strain suitable for the tenderization of beef, a total of 22 bacteria of producing proteinase were isolated from traditional lobster sauce and wine song in Guizhou. With the screening by using microscopy, analyses of enzyme activities, and TPA value of beef with in treatment of fermented broth, a bacteria defined as D7 was found the optimal strain, and its enzyme activity was 71.68 U/g. The molecular biological identification results showed that it was very similar toBacillusamyloliquefaciens(JN700123.1), and the similarity was 99%, on the basis of molecular biology identification, using 16S rDNA sequences identification and phylogenetic analyses. Thus this strain was identified asBacillusamyloliquefaciens.

protease; enzyme activity;Bacillusamyloliquefaciens; texture profile analysis(TPA); 16S rDNA

公益性行業(農業)科研專項(編號：201303082)；湖南省科技廳重點項目(編號：2015NK2096)；湖南省科技項目(編號：2015WK3015)；湖南省科技廳科技計劃重點研發項目(編號：2016NK2038)

譚雅，女，湖南農業大學在讀碩士研究生。

李宗軍(1967-)，男，湖南農業大學食品科技學院教授，博導。E-mail：hnlizongjun@163.om

2016—08—23

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.11.004