微孔板法篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑的條件優化

王紅月

陳 中1

簡旭鳳2

(1. 華南理工大學食品工程與科學學院，廣東 廣州 510640；2. 安利日用品公司，廣東 廣州 510730)

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微孔板法篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑的條件優化

王紅月1

陳 中1

簡旭鳳2

(1. 華南理工大學食品工程與科學學院，廣東 廣州 510640；2. 安利日用品公司，廣東 廣州 510730)

研究以微孔板檢測法為基礎，對α-葡萄糖苷酶抑制劑的抑制能力進行檢測，以達到有效篩選適宜濃度的α-葡萄糖苷酶抑制劑用于制備降血糖類功能性食品的目的。試驗針對酶濃度、檢測波長、蔗糖底物濃度及酶反應時間進行反應條件優化。結果表明：試驗中所用批次酶的最適濃度范圍為2.0～3.0 mg/mL；在405，450，492，520，630 nm 5種波長條件下，520 nm和492 nm波長檢測信號最強；蔗糖底物濃度的合適范圍應為20～40 mmol/L；適宜的酶反應時間范圍為20～30 min。

α-葡萄糖苷酶抑制劑；血糖；微孔板法

糖尿病是一種終身慢性疾病，臨床上除了藥物治療手段外，飲食治療也是糖尿病的一種基本食療方法。近年來國內外利用天然產物和膳食防治糖尿病及其并發癥已成為研究熱點[1]。天然α-葡萄糖苷酶抑制劑在糖尿病飲食療法中有重要作用，可用于功能性食品中，有效預防、控制糖尿病的產生與發展。開發含天然α-葡萄糖苷酶抑制劑的降血糖功能性食品及降糖功能性食品配料具有廣泛的應用前景。

α-葡萄糖苷酶主要分布于小腸刷狀緣膜上皮細胞，在代謝中是水解碳水化合物的關鍵酶，它能從低聚糖類底物的非還原端切開α-1,4-糖苷鍵，從而釋放出葡萄糖，葡萄糖再經小腸吸收進入血液，導致機體血糖水平的上升[2-3]。它參與了人體對碳水化合物的消化吸收、糖蛋白和糖脂的加工，與許多因代謝紊亂失調而引起的疾病(如糖尿病[4])、免疫反應[5-6]、神經細胞的分化[7]、腫瘤的轉移以及病毒和細菌的感染[8]有密切關系。

α-葡萄糖苷酶抑制劑能競爭性地抑制α-葡萄糖苷酶，在碳水化合物消化的最后一步抑制雙糖降解為單糖，從而延緩碳水化合物在腸道的消化，減緩來自雙糖、低聚糖及多糖水解產生的葡萄糖的吸收，可以有效推遲并減輕糖尿病人餐后血糖水平升高的時間及進程[9-10]。

1966年在鏈霉素的代謝物中，首次發現了野尻霉素(nojirimycin)[11]，在后續的研究[12]中，又發現了由鏈霉菌、芽孢桿菌和枯草桿菌產生的1-脫氧野尻霉素(1-deoxyrijimycin，DNJ)，并在相關的研究[13]中顯示，DNJ對α-葡萄糖苷酶有強烈的抑制作用。DNJ是一種含氮生物堿，在桑屬植物中的含量較高[14]，其結構與D-葡萄糖類似，兩者不同之處是：在六元環中，DNJ的氮原子取代了D-葡萄糖氧原子，由于它們結構上的相似性，DNJ能夠和D-葡萄糖競爭與α-葡萄糖苷酶發生作用，是這類酶的強競爭性抑制劑[15]。

微孔板檢測技術由于方法簡單，使用靈活且具有高通量性而在生物化學以及細胞生物學中得到了廣泛的應用。這種檢測方法能快速檢測大量樣品小樣本量的抑制劑的存在，可以加快α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選和研發步伐。學者在α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選模型方面進行了大量的研究工作。其中酶-抑制劑篩選模型大多以4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)為底物，但由于PNPG為麥芽糖類似物，所以只能篩選到對麥芽糖酶有抑制作用的抑制劑，有一定的局限性[16]。本篩選模型以蔗糖為底物，也可將底物更換為淀粉或蔗糖，可以針對不同的底物進行定向篩選。本研究擬以96孔微孔板檢測技術為基礎，以DNJ為標準參考物，以蔗糖為水解底物，測定α-葡萄糖苷酶在抑制劑存在的情況下水解蔗糖所產生的葡萄糖量。加入與葡萄糖特異性結合的顯色試劑，通過酶標儀測定96孔試驗板中的在一定檢測波長下的吸光度，算出葡萄糖的具體含量，從而計算出α-葡萄糖苷酶抑制劑的抑制能力。同時針對不同的酶濃度、檢測波長、底物濃度、及酶反應時間對該反應進行最佳反應條件的摸索，這種方式可以應用到不同底物的酶-底物篩選模型，為α-葡萄糖苷酶抑制劑的定向篩選提供更多種類的篩選形式。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑

小鼠腸干粉(Rat Intestinal Acetone，RIA)：美國Sigma公司；

蔗糖：≥99.9%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

葡萄糖分析試劑(Glucose Assay Reagent，GAR)：日本Wako公司；

DNJ標準粉末：美國Chromdex公司；

磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、碳酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸：分析純，廣州市化學試劑廠；

試驗用水為去離子水。

1.2 試驗設備

分析天平：AB304S/FACT型，美國Mettler Toledo公司；

離心機：H-28型，日本Kokusan公司；

酶標儀：MK3型，美國Thermo Fisher Scientific公司；

恒溫培養箱：307型，美國Thermo Fisher Scientific公司；

真空烘箱：273800型，美國Hot Pack公司；

pH計：PH744型，瑞士Metrohm技術公司；

手動單道移液槍：100-1000μL型，德國Eppendorf公司；

手動單道移液槍：10-100μL型，德國Eppendorf公司；

8通道移液槍，Transferpette-8型，德國Eppendorf公司；

96孔微孔板(平底)，9018型，美國Corning公司

1.3 試劑配制

(1) Enzyme Assay Buffer(以下簡稱Buffer)：pH 7.0。分別配制50 mmol磷酸二氫鉀溶液與50 mmol磷酸氫二鈉溶液。在1 L燒杯中混合600 mL磷酸氫二鈉(50 mmol)和300 mL磷酸二氫鉀(50 mmol)，用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl調pH至7.0(精確至0.02)。

(2) DNJ溶液：DEOXYNOJIRIMYCIN(SH)，8 mg/mL。可以按12 μL/離心管的體積分裝，于-20 ℃冰箱保存1年。

(3) Ymin溶液：40 μg/mL。

(4) 酶溶液(Enzyme Solution)：1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mg/mL，使用前配制。

(5) 蔗糖溶液(底物)：10，20，40，60，80，100 mmol/L，使用前配制。

(6) Glucose Assay Reagent (GAR)：Wako Chemicals USA.In.，根據Glucose Kit說明書制備顯色劑。

1.4 試驗方法

1.4.1 酶反應濃度的確定 取一塊淺孔分析平板，按表1配制不同酶濃度的反應體系，每孔加入20 mmol/L的蔗糖溶液60 μL，加入6種不同濃度(1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mg/mL)的酶溶液各30 μL，以30 μL H2O(即Ymax)和30 μL DNJ(40 μg/mL，即Ymin)作為樣品加入反應體系，比較在沒有抑制劑下(Ymax)和在最大濃度抑制劑下(Ymin)酶反應的差異。每個反應組合做3個平行和3個不加酶的對照。加完所有試劑后，用膜封好微孔板，于37 ℃孵育25 min。去除封膜，用排槍吸120 μL的Glucose Assay Reagent 至所有的孔。用膜封好微孔板，37 ℃孵育5 min。在520 nm波長下檢測吸光度。計算出每孔的ODnet(加酶反應吸光度讀數減去無酶反應的吸光度讀數)，以ODnet為縱坐標，酶溶液終濃度為橫坐標，分別作出不同酶濃度下的ODnet變化曲線，觀察酶濃度對抑制反應的變化規律。

表1 不同酶濃度下的反應體系Table 1 Reactionsystemin different enzyme concentration

1.4.2 檢測波長的確定 按表1配制的不同酶濃度的分析平板，分別在405，450，492，520，630 nm 5個波長下檢測吸光度。計算出每個反應組合的Ymax ODnet均值和Ymin ODnet，以吸光度為縱坐標，酶溶液終濃度為橫坐標，分別作出不同檢測波長下和不同酶濃度下的均值差變化曲線，觀察信號最強的檢測波長。

1.4.3 底物濃度的確定 取一塊淺孔分析平板，按表1配制不同蔗糖底物濃度的反應體系，分別加入60 μL不同稀釋倍數(10，20，40，60，80，100 mmol/L)的蔗糖底物溶液，1～6列分別加入3.0 mg/mL左右的酶溶液各30 μL，7～12列分別加入30 μL同體積水溶液。以30 μL H2O(即Ymax)和30 μL DNJ(40 μg/mL，即Ymin)作為樣品加入反應體系，比較在沒有抑制劑下(Ymax)和在最大濃度抑制劑下(Ymin)不同蔗糖底物濃度的差異。每個反應組合做3個平行和3個不加酶的對照。加完所有試劑后，用膜封好微孔板，于37 ℃孵育25 min。去除封膜，用排槍吸120 μL的Glucose Assay Reagent 至所有的孔。用膜封好微孔板，37 ℃孵育5 min。在520 nm波長下檢測吸光度。計算出每孔的ODnet(加酶反應吸光度讀數減去無酶反應的吸光度讀數)，以吸光度為縱坐標，不同濃度蔗糖底物溶液為橫坐標，分別作出不同酶濃度下的Ymax ODnet與Ymin ODnet的變化曲線，觀察酶濃度對抑制反應的變化規律。

1.4.4 酶反應時間的確定 取一塊淺孔分析平板，按表1配制不同時間的反應體系。反應時間分別為5，10，15，20，25，30 min，分別加入60 μL 20 mmol/L的蔗糖底物溶液，其中1～6列分別加入3.0 mg/mL左右的酶溶液各30 μL，7～12列分別加入30 μL同體積水溶液。以30 μL H2O(即Ymax)和30 μL DNJ(40 μg/mL，即Ymin)作為樣品加入反應體系，比較在沒有抑制劑下(Ymax)和在最大濃度抑制劑下(Ymin)不同反應時間的差異。每個反應組合做3個平行和3個不加酶的對照。加完所有試劑后，用膜封好微孔板，于37 ℃孵育25 min。去除封膜，用排槍吸120 μL的Glucose Assay Reagent 至所有的孔。用膜封好微孔板，37 ℃孵育5 min。在520 nm波長下檢測吸光度。計算出每孔的ODnet(加酶反應吸光度讀數減去無酶反應的吸光度讀數)，以吸光度為縱坐標，不同時間為橫坐標，分別作出不同反應時間下的Ymax ODnet與Ymin ODnet變化曲線，觀察反應時間對抑制反應的變化規律。

2 結果與討論

2.1 最佳酶濃度

由圖1可知，在520 nm檢測波長下，Ymax ODnet和Ymin ODnet均隨著酶濃度的降低而降低。其中，酶濃度達到2.0～3.0 mg/mL時的吸光度最能滿足微孔板法對酶活性的要求(Ymax ODnet為0.190～0.280。Ymax ODnet低于0.190時，微孔板顯色整體較弱，酶解反應抑制曲線梯度不明顯；高于0.280時，微孔板整體顯色過強，酶解反應抑制曲線梯度同樣不明顯)，所以在520 nm檢測波長下，酶濃度合適范圍應為2.0～3.0 mg/mL。

圖1 不同酶濃度下Ymax ODnet均值與Ymin ODnet 均值的變化曲線Figure 1 Curve of Ymax ODnet and Ymin ODnet in different enzyme concentration system

2.2 最佳檢測波長

由圖2可知，在405，450，492，520，630 nm 5種檢測波長下，檢測吸光度。520 nm和492 nm波長下檢測信號最強，兩者強度相當，且檢測強度均隨著酶濃度的降低而降低。

2.3 最佳底物濃度

由圖3可知，在520 nm檢測波長下，Ymax ODnet和Ymin ODnet均隨著蔗糖底物濃度的升高而升高。其中，蔗糖底物濃度達到20～40 mmol/L時的吸光度最能滿足微孔板法對酶活性的要求(Ymax ODnet為0.190～0.280。當Ymax ODnet低于0.190時，微孔板顯色整體較弱，酶解反應抑制曲線梯度不明顯；高于0.280時，微孔板整體顯色過強，酶解反應抑制曲線梯度同樣不明顯)，所以在520 nm檢測波長下，蔗糖底物濃度合適范圍應為20～40 mmol/L。

圖2 不同波長與酶濃度下Ymax ODnet均值與 Ymin ODnet均值差的變化曲線Figure 2 The difference value curves in different wavelengths and enzyme concentration

圖3 不同蔗糖底物濃度下Ymax ODnet與Ymin ODnet 的變化曲線

Figure 3 The curve of Ymax ODnet and Ymin ODnet in different substrate concentration system

2.4 最佳酶反應時間

由圖4可知，在520 nm檢測波長下，Ymax ODnet和Ymin ODnet均隨著反應時間的增加而升高。其中，反應時間達到20～30 min時吸光度最能滿足微孔板法對酶活性的要求(Ymax ODnet為0.190～0.280)，所以在520 nm檢測波長下，反應時間的合適范圍應為20～30 min。

圖4 不同反應時間下Ymax ODnet與Ymin ODnet 的變化曲線

Figure 4 The curve of Ymax ODnet and Ymin ODnet in different reaction time system

3 結論

本研究以96孔微孔板檢測技術為基礎，以DNJ為標準參考物，蔗糖為水解底物，測定α-葡萄糖苷酶抑制劑的抑制能力。研究影響抑制反應關鍵的4個因素——酶濃度、檢測波長、底物濃度、及反應時間的影響，得到更穩定的α-葡萄糖苷酶抑制劑檢測方案：在520 nm檢測波長下，最佳的酶反應濃度為2.0～3.0 mg/mL；在405，450，492，520，630 nm 5種檢測波長下，520 nm和492 nm波長下檢測信號最強；在520 nm檢測波長下，蔗糖底物濃度合適范圍為20～40 mmol/L；在520 nm檢測波長下，酶反應的最佳時間應為20～30 min。不過，該試驗以是以體外檢測為主，而α-葡萄糖苷酶抑制劑在體內的吸收及發揮抑制作用的情況有待進一步研究。

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Optimization of a microplate bioassay method of filtering alpha-glucosidase inhibitors

WANG Hong-yue1

CHENZhong1

JIANXu-feng2

(1.SchoolofFoodScienceandEngineering,SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou,Guangdong510640,China; 2.AmwayChinaCo.Ltd,Guangzhou,Guangdong510730,China)

The half inhibitory concentration (IC50) of alpha glucosidase inhibitors was detected based on a microplate assay method in this study in order to find the effective inhibitors for preparing hypoglycemic functional food. The reaction conditions were optimized by the four aspects, i.e., the enzyme concentration, the detection wavelength, the substrate concentration and the reaction time. The results showed that the optimum enzyme concentration ranged from 2.0 mg/mL to 3.0 mg/mL, and waves 520 nm and 492 nm were optimum among the five waves, 405, 450, 492, 520, 630 nm. Moreover, the suitable substrate concentration of sucrose ranged from 20 mmol/L to 40 mmol/L, and the appropriate reaction time was about 20～30 min.

alpha glucosidase inhibitors; blood glucose; microplate bioassay

王紅月(1984—)，女，安利中國日用品有限公司工程師，碩士。E-mail: why-1648@163.com

2016-07-25

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.11.003