水稻土中紫色光合細菌沿緯度梯度的空間分異特征

俎千惠,王保戰,賈仲君,林先貴,馮有智,*

1 中國科學院南京土壤研究所,土壤與農業可持續發展國家重點實驗室, 南京 210008 2 中國科學院大學研究生院, 北京 100049

水稻土中紫色光合細菌沿緯度梯度的空間分異特征

俎千惠1,2,王保戰1,賈仲君1,林先貴1,馮有智1,*

1 中國科學院南京土壤研究所,土壤與農業可持續發展國家重點實驗室, 南京 210008 2 中國科學院大學研究生院, 北京 100049

紫色光合細菌由于其代謝途徑的多樣性,在環境中廣泛分布,是生態系統中碳循環的參與者和推動者之一。但是,水稻土中紫色光合細菌群落結構的空間分異卻鮮有報道。基于此,沿我國溫度梯度帶(緯度梯度：28.38° N—47.43° N),采集了8個典型水稻土,利用PCR-DGGE指紋圖譜和系統發育樹分析揭示不同地點水稻土中紫色光合細菌群落的組成；結合多個環境因子,利用生物信息學,典范對應分析(Canonical Correspondence Analysis, CCA)和最小判別效應分析(Cladogram, LDA)明確水稻土中紫色光合細菌的空間分異規律。研究發現我國8個典型水稻土中紫色光合細菌主要由變形菌門(Proteobacteria)的α和β這兩個分支組成,主要為紫色非硫細菌；pH和緯度都是驅動水稻土中紫色光合細菌群落結構分異的關鍵因子。該認知不僅有助于更好地揭示稻田關鍵功能微生物群的生物地理學分布,還有助于進一步探究我國稻田生態系統有機質轉化的時空差異。

水稻土；紫色光合細菌；PCR-DGGE指紋圖譜；典范對應分析；群落組成空間分異

光合微生物是一類地球上最早出現的具有原始光能合成體系的原核生物。紫色光合細菌是光合微生物的重要組成部分,也是生態系統中一類重要的微生物[1]。紫色光合細菌具有極其多樣的碳源代謝能力,它們可以代謝幾乎所有的發酵產物、CO2、小分子有機酸、甚至CH4[2]。CO2是紫色光合細菌平衡氧化還原電位所必需的電子受體,也是紫色光合細菌可利用的碳源之一。大部分紫色光合細菌以Calvin-Benson循環吸收CO2,少部分利用C4循環[3]。此外,有機物也是影響紫色光合細菌生長的一個重要因素：紫色光合細菌的環式光合磷酸化需要外源性的有機物或硫化物補充電子以合成NAD(P)H；同時,有機物又是紫色光合細菌的主要碳源。紫色光合細菌喜好的有機物為各類小分子有機酸,如甲酸、乙酸、丙酮酸、蘋果酸等。極其多樣的碳源代謝能力使紫色光合細菌廣泛存在于各個生態系統中,并成為碳循環的主要參與者和推動者[4]；同時,紫色光合細菌具有固氮能力,可以給生態系統提供氮素,進而提高土壤肥力[5]。

目前對于紫色光合細菌的研究多集中在海洋生態系統,主要以編碼光吸收系統中保守性蛋白的結構基因為生物標記物對紫色光合細菌進行研究,例如廈門大學焦念志等利用pufM基因對中國沿海水域進行研究,發現海水樣本中含有豐富的pufM基因型,主要為類γ-變形菌綱pufM基因型(34.5%)[6]。隨后,焦念志等又利用pufM基因全面研究了太平洋、大西洋和印度洋中紫色光合細菌的豐度和多樣性變化[7],發現各大洋水體中都有豐富的資源,并且其海水營養狀態和其豐度成正相關,而與其多樣性成負相關。Karr等[8]利用pufM基因對南極湖水中紫色光合細菌研究發現湖水中存在豐富的紫色非硫細菌資源,并沿水體深度呈現不同的群落結構。相對于水生生態系統,陸地生態系統中紫色光合細菌的研究相對較少。其部分原因是紫色光合細菌是厭氧微生物,很少存活在有氧環境中,且不能發揮生態功能。但是,紫色光合細菌仍可以在陸地生態系統中合適的環境下生長。例如本研究組利用pufM基因對北極地區33個土壤樣品進行紫色光合細菌多樣性的研究,發現由于常年處于冰封的環境,北極土壤中也含有豐富的紫色光合細菌資源,主要為紫色非硫細菌[9]。此外,水稻土也是紫色光合細菌喜好的生存場所。稻田土壤富含有機質,同時由于其耕作方式而飽含水分,因此水稻土中含有數量眾多,多樣性豐富的紫色光合細菌[10]。在水稻土中,紫色光合細菌由于自身含有多種生物類激素,能夠作為一種生物肥料促進水稻的增產[11]。此外,紫色光合細菌還參加水稻土中多個元素的循環過程。Byrne等[12]發現紫色光合細菌,Rhodopseudomonas作為鐵氧化細菌而參與鐵的氧還過程。本課題組前期的研究發現水稻土中紫色光合細菌驅動著一個自下而上的微生物食物網絡,通過該食物網絡,土壤微生物驅動著C、N等物質循環過程[13]。然而,目前對水稻土中紫色光合細菌群落特性,特別是大尺度下的其地理學分布的認識還嚴重不足。而該認知能夠幫助人們更好的揭示微生物所驅動的稻田生態系統養分和物質循環過程。

我國地域遼闊,從南到北呈現明顯的溫度梯度帶,且土壤類型眾多,決定了我國土壤碳含量及其轉化功能存在巨大的時空變異[14-15]。土壤中有機質降解和轉化由土壤微生物參與和驅動,因此在我國溫度梯度帶上,參與土壤有機質降解和轉化的微生物群落結構和功能也必將存在分異和不同。本課題組前期的研究已經發現,處于稻田生態系統碳循環末端的產甲烷古菌在地理學分布已呈現一定的規律性變化[16]。這也預示著同為稻田生態系統碳循環末端的紫色光合細菌群落結構也將存在時空分異。基于以上認知和前期的工作結果,本研究沿我國緯度梯度變化,從北向南采集了8種典型水稻土(黑龍江海倫、江蘇揚州、江蘇常熟、四川資陽、浙江嘉興、湖南古市、湖南桃源和江西鷹潭),利用PCR-DGGE指紋圖譜和系統發育分析揭示不同地點水稻土中紫色光合細菌群落組成,結合環境因子,利用生物信息學,典范對應分析(Canonical Correspondence Analysis, CCA)和最小判別效應分析(Cladogram, LDA)明確紫色光合細菌群落組成的空間分異規律。

1 材料和方法

1.1 供試土壤信息

采集我國不同緯度的海倫、揚州、常熟、資陽、嘉興、古市、桃源和鷹潭地區8個典型水稻土,如表1所示。每個地區水稻種植年限都超過50a。于2011年在鷹潭、桃源、古市、嘉興和資陽晚稻收獲期后一周內采樣,海倫、揚州和常熟為水稻季收獲期后一周內采樣。每個采樣點相隔20 m,共采樣3處。各個采樣點隨機取6個0—5 cm的水稻土,去除其中的植物殘體、根系和石頭后充分混勻。用于分子實驗的土壤樣品于-40℃保藏,用于土壤理化性質測定的土壤樣品經自然風干后過20目(0.90 mm孔徑)分樣篩備用。

1.2 土壤理化性質的測定

利用酸度計測定土壤的pH值(水土比2.5∶1)；分別利用靛酚藍比色法、鍍銅鎘還原-重氮化偶合比色法和凱氏定氮法測定土壤的銨態氮、硝態氮、總氮含量；土壤有機質含量采用H2SO4-K2Cr2O7氧化-容量法進行測定[17]；各樣點年平均溫度參考各地方氣象臺信息。

1.3 土壤總DNA提取

土壤總DNA采用FastDNA SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals, Santa Ana, CA)試劑盒和Fast PrepTMFP120核酸提取儀提取。按照試劑盒說明書提取DNA,并將提取到的DNA溶解于75 μL的ddH2O,保存于-20℃。

1.4 PCR-DGGE指紋圖譜分析1.4.1 PCR擴增

紫色光合細菌光反應中心蛋白M亞基編碼基因片段pufM基因的特異性引物對pufM557F (5″-CGCACCTGGACTGGAC- 3″),pufM750R (5″-CCCATGGTCCAGCGCCAG AA- 3″)進行pufM基因擴增[18]。PCR反應用試劑盒PremixTaq? Version 2.0 Kit (TaKaRa),50 μL的PCR體系添加50 ng的DNA模板量。PCR反應條件：94℃ 3 min；94℃ 30 s,56℃ 30 s,72℃ 30 s,30個循環；72℃ 10 min。PCR擴增產物在1.2% (W/V) Tris-acetate- EDTA (TAE)瓊脂糖凝膠中電泳驗證。PCR產物保存于4℃。

1.4.2 變性梯度凝膠電泳(DGGE)

采用BIO-RAD Dcode系統(Bio-Rad, CA, USA)對紫色光合細菌pufM基因片段PCR產物進行DGGE指紋圖譜電泳。使用8%聚丙烯酰胺凝膠,電泳緩沖液為1×TAE,變性梯度為45%—70%；PCR產物上樣量為200 ng DNA；電壓80 V,60℃,電泳13 h；用SYBR Green I (Invitrogen) (1:10000,V/V)染色30 min,后用Gel DocTMEQ imager (Bio-Rad)成像拍照[19]。

將DGGE特征條帶割膠,放入含有40 μL去離子水的1.5 mL的離心管中,置于4℃冰箱過夜。以此溶液為模板,再次使用pufM基因引物對其進行擴增。PCR擴增體系和反應條件如上。將擴增后的PCR產物進行DGGE驗證,以確定各個pufM基因型的位置和純度。如不符,繼續切帶、擴增和驗證。

1.5 克隆測序和構建系統發育樹

將驗證后的pufM基因片段PCR擴增產物連接到pMD 18-T vector (TaKaRa),并轉化到EscherichiacoliDH5α感受態細胞中,在含有X-gal、IPTG和氨芐青霉素的LB培養基上培養過夜。挑取具有氨芐青霉素抗性的白色轉化子,采用T載體通用引物M13進行菌落PCR,擴增產物經1.2% (W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測是否為陽性克隆。將含有正確克隆子的細胞擴大液交由上海Invitrogen公司進行測序。將測序得到的序列在National Center for Biotechnology Information (NCBI)網站上BLAST比對,進行同源性檢索。利用Cluster W軟件對本實驗獲得的產甲烷古菌基因序列以及NCBI中親緣性最高的基因序列進行多重序列比對,根據N-J(Neighbor-Joining)法,利用MEGA 4.0軟件構建系統發育樹。

1.6 統計分析

運用SPSS 13.0進行統計分析,并使用Tukey檢驗進行多重比較(P<0.05)。用Quantity One 4.4.0(Bio-Rad)對紫色光合細菌DGGE指紋圖譜進行數字化分析；利用軟件Canoco for Windows(version 4.5)進行紫色光合細菌群落組成分異和各個環境因子變化相關性的典范對應分析(Canonical Correspondence Analysis, CCA)；在http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/網站上進行最小判別效應分析。

2 實驗結果

2.1 土壤理化性質分析

8個地區土壤樣品的理化性質如表1所示：資陽的pH和硝態氮含量最高,而pH最低的是桃源地區,硝態氮最低的是鷹潭；銨態氮、全氮和有機質的分布相似,最高值都出現在古市,最低值則出現在海倫；而在碳氮比方面,海倫的比值最大,嘉興和資陽的比值最小。

表2 8個地區水稻土化學特性

數據為3個重復均為平均值±標準差,不同字母顯示數據差異顯著性(P<0.05)

2.2 8個地區水稻土中紫色光合細菌群落組成的DGGE指紋圖譜

PCR-DGGE指紋圖譜用于分析8個地區水稻土中紫色光合細菌群落組成的差異(圖1)。通過比較8個地區樣品的條帶數量和光密度值可以看出各個地區的條帶數量和強度(豐度)差異明顯。其中資陽地區的條帶數量最豐富,共有28個優勢條帶,而鷹潭地區的條帶數量最少,優勢條帶只有7個。此外,不同條帶在各個樣品間的分布和強度也不盡相同,例如條帶18是8個地區的共有條帶；而條帶1是海倫地區所特有的,條帶2是資陽地區所特有的,條帶3為海倫、揚州、常熟、嘉興和古市所共有的。在條帶的光密度上,條帶4、8、14、24在揚州的豐度最高,條帶5、11、22、23、26、28在資陽的豐度最高,條帶6、7、15在海倫的豐度最高,條帶9、12、17、18、20、21、25、27在常熟的豐度最高,條帶10在桃源的豐度最高,條帶13在鷹潭的豐度最高,條帶16在古市的豐度最高。

圖1 pufM基因片段的DGGE指紋圖譜Fig.1 DGGE fingerprinting profiles of pufM genes

2.3 紫色光合細菌多樣性指數分析

根據DGGE指紋圖譜中展示的條帶,對8個樣品中光合細菌群落的多樣性進行Shannon和Richness指數分析,結果如圖2所示。從圖中可以看出,8個樣品的Shannon多樣性指數存在差異,其中常熟和揚州的Shannon多樣性最高,桃源和鷹潭最低；與之相類似,Richness多樣性指數也呈現出相同規律,其中常熟和揚州的Richness多樣性指數最高,而桃源和鷹潭最低。Shannon和Richness多樣性指數與所有環境因子均無相關性。

2.4 紫色光合細菌系統發育分析

從系統發育分析可以看出,8個地區的紫色光合細菌主要隸屬于變形菌門(Proteobacteria)的α和β的這兩個分支上,紫色非硫細菌主導水稻土中紫色光合細菌。其中,8個地區所共有的條帶18隸屬于Roseivivax；海倫、揚州、常熟、嘉興和古市所共有的條帶3與Rhizobiales的親緣性最高,同時,海倫地區所特有的條帶1,以及資陽地區所特有的條帶2都與Rhizobiales的親緣性最高。出現在中緯度地區的條帶26和28分別隸屬于Rhodobacter和Rhodovulum。

2.5 8個地區水稻土中紫色光合細菌群落結構的CCA分析

利用8個地區的紫色光合細菌群落結構的DGGE圖譜條帶和8個主要的環境因子做CCA分析(圖4)。從圖中可以看出,在橫坐標上pH是主要的影響因素,貢獻率為29.8%；縱坐標上C/N是主要的影響因素,貢獻率為20.5%。溫度、硝態氮與全氮對紫色光合細菌的影響方向一致,與緯度因子的影響方向相反。根據紫色光合細菌群落組成的相似性,從主要相關因素pH因子上看,pH值較高的資陽地區位于左側,pH值較低的桃源和鷹潭位于右側。C/N較高的海倫、揚州位于下部,比值較低的資陽位于圖中的上部。緯度較高的鷹潭、桃源、嘉興和古市聚在一起,緯度較低的常熟、海倫和揚州聚在一起。

圖2 紫色光合細菌Shannon和Richness多樣性指數分析Fig.2 Purple photosynthetic bacteria Shannon and Richness diversity indices

圖3 8個地區水稻土中優勢紫色光合細菌pufM基因片段的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic analysis showing the relationships of pufM genes in DGGE fingerprinting profiles to the closest relatives in GenBankThe numbers at the nodes indicate the percentages of occurrence in 1000 bootstraped trees. The GenBank accession number of each strain is indicated in parentheses and the scale bar represents 5% sequences difference

2.6 最小判別效應分析

將8個地區的物種信息進行最小判別效應分析,結果如圖5所示。在8個地區中海倫、桃源和鷹潭地區的紫色光合細菌物種差異最顯著,其中,鷹潭地區由于具有14個Unclassified species的優勢條帶而與其他地區相區別,海倫地區具有較多的隸屬于Rhizobiales門的優勢條帶而與其他地區相區別,而桃源地區由于缺少隸屬于Rhodobacterales門的優勢條帶和其他地區不同。

3 討論

目前,關于紫色光合細菌的研究主要集中在水生生態系統,對于陸地生態系統特別是稻田生態系統的關注較少。基于以上原因,本文開展了相關研究。首先,通過PCR-DGGR指紋圖譜,展示出我國8個典型水稻土樣品中紫色光合細菌的群落組成(圖1),以及各自優勢物種在數量和多樣性的差異(圖2)。8個地區的紫色光合細菌主要隸屬于變形菌門(Proteobacteria)的α和β的這兩個分支上,為紫色非硫細菌(圖3)。這與本課題組之前的研究結果一致[18],說明水稻土中的紫色光合細菌含有豐富的多樣性。紫色光合細菌主要分為兩大類,紫色非硫細菌和紫色硫細菌。前者主要利用有機質異養生長,而紫色硫細菌主要利用光能自養生長。土壤生態系統與水生生態系統相比,富含有機質,且日光只能進入土壤幾個厘米,絕大多數環境處于黑暗狀態,因此水稻土中紫色光合細菌主要為α-和β- Proteobacteria類的紫色非硫細菌,而水生生態還含有大量γ- Proteobacteria類的紫色光合細菌[6,20]。紫色非硫細菌是一類具有重要生態功能的紫色光合細菌,例如Rhodobacter和Rhodopseudomonas。例如Byrne等[12]發現Rhodopseudomonas作為鐵氧化細菌和Geobacter共同參與鐵的氧還過程；本課題組研究發現水稻土中以Rhodopseudomonas為主的紫色光合細菌驅動著一個自下而上的微生物食物網絡,通過該食物網絡,土壤微生物驅動著C、N等物質循環過程[13]。結合本研究的結論,我們可以推斷以上過程可能普遍存在于稻田生態系統。該認知將有助于我們更好的認識稻田生態系統中養分循環機制。

鑒于紫色光合細菌是一類具有重要生態功能的土壤微生物,又進一步研究了其地理學分布。PCR-DGGR指紋圖譜明確的揭示出8個地區紫色光合細菌在群落組成上的差異性(圖1)。8個地區中優勢條帶的數量和種類都不相同,其中,資陽地區的條帶數量最豐富,共有28個優勢條帶,而鷹潭地區的條帶數量最少,優勢條帶只有7個。從資陽到鷹潭,物種數量呈現一定遞減的趨勢。為了更好地展示紫色光合細菌群落在不同地點差異及其驅動因子,將其與環境變量相結合,進行典范對應分析以及最小判別效應分析。研究發現,在多種環境因子中pH和緯度(溫度)是影響水稻土中紫色光合細菌群落發生分異的關鍵因素(圖4和5)。pH是土壤的一個重要環境因子,它由多種環境因素所共同決定[21]；在前期的工作中,本課題組已經證明,在北極地區的土壤中,pH對紫色光合細菌群落組成和多樣性都有重要影響[9],是預測土壤中微生物群落發生分異的重要因素。其部分原因是由于紫色光合細菌細胞表面zeta電位的需求[22]：在同化CO2時,紫色光合細菌必須盡量保持自己的細胞膜不處于負電荷狀態,以保證不(少)吸附Ca2+和保護自己不被CaCO3沉淀所傷害[23]。因此,pH值對紫色光合細菌細胞膜的zeta電位影響很大[24],進而對其群落結構也影響很大。同時,與水稻土中紫色光合細菌生態位相似,同處在碳循環末端的產甲烷古菌也被證實pH是影響其群落分異的主要驅動因子[16]。此外,緯度也是影響土壤中紫色光合細菌群落分異的關鍵環境因素。前期工作也發現溫度(緯度)對產甲烷古菌的群落結構也有影響[16]。溫度上升,增加土壤微生物數量和多樣性[25],增強土壤微生物代謝活性[26],從而促進土壤碳轉化效率[9]。因此,CCA圖上顯示緯度和土壤理化性質有著較高的相關性(圖4)。紫色光合細菌是碳循環末端的微生物,溫度升高通過增加底物供應而影響其群落結構。在研究中發現一些Roseivivax出現在緯度較高的海倫地區,而在低緯度地區并沒有出現,例如條帶15(圖1和圖5)。所以在緯度(溫度)梯度上,紫色光合細菌群落結構也發生分異。

圖4 8個地區水稻土中紫色光合細菌群落組成的典范對應分析Fig.4 Canonical correspondence analysis relating DGGE fingerprinting patterns with environmental variables

圖5 8個地區水稻土中紫色光合細菌群落組成的最小判別效應分析Fig.5 Cladogram analysis showing the community structure about purple photosynthetic bacteria

綜上所述,本研究發現水稻土中含有豐富的紫色光合細菌資源,主要為紫色非硫細菌。8個地區差異分析發現pH和緯度(溫度)是影響水稻土中紫色光合細菌群落分異的2個關鍵因素。此外,本研究還發現水稻土中還有很多尚未發現的紫色光合細菌物種。由于PCR-DGGE指紋圖譜只能半定量的表征物種的多樣性,靶標土壤中少數優勢微生物,所以今后還可以在更高的分辨率和更大的基因通量下深入的研究水稻土中紫色光合細菌的空間分異規律。

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Spatial shifts in purple photosynthetic bacterial community composition in paddy soils along the latitude

ZU Qianhui1,2, WANG Baozhan1, JIA Zhongjun1, LIN Xiangui1, FENG Youzhi1,*

1StateKeyLaboratoryofSoilandSustainableAgriculture,InstituteofSoilScience,ChineseAcademyofSciences,Nanjing210008,China2GraduateUniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China

Purple phototrophic bacteria (PPB) are a diverse group of Proteobacteria that can use sulfur, hydrogen, iron, or organic compounds as electron donors during light harvesting reactions. Because of their metabolic diversity, PPBs are distributed in a wide variety of ecosystems. They participate in, as well as drive, the processes of the carbon cycle in ecosystems. Among terrestrial ecosystems, paddy soils are a preferred PPB habitat. However, gaps exist in our knowledge about PPB community composition in paddy soil and spatial shifts across a large geologic scale. We studied the spatial distribution of PPB in nine representative paddy sites, along a large latitudinal gradient ranging from 28.38° N to 47.43° N in China, using PCR-DGGE fingerprinting and phylogenetic analyses. Mechanisms for the spatial shifts in community composition were further elucidated by canonical correspondence analyses and cladograms. It was found that the dominant paddy PPB guilds are purple non-sulfur bacteria, affiliated with alpha and beta branches of Proteobacteria. Soil pH and air temperature (latitude) were the main environmental triggers that influenced PPB community composition in paddy soil. This knowledge will help us to better understand the key species in paddy soil. In addition, this information will contribute to the comprehensive understanding of spatial shifts in the transformation of organic matter along the Chinese latitudinal gradient.

paddy soil; Purple photosynthetic bacteria; PCR-DGGE fingerprinting;canonical correspondence analysis; spatial shifts in community composition

國家自然科學基金重點項目(41430859)；國家自然科學基金項目(41271256)；中國科學院戰略性先導科技專項(B類)(XDB15020104)；土壤與農業可持續發展國家重點實驗室優秀青年人才項目(212000009)

2015- 04- 21;

日期:2016- 03- 03

10.5846/stxb201504210819

*通訊作者Corresponding author.E-mail: yzfeng@issas.ac.cn

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