肝素對氟尿嘧啶誘導的人臍靜脈內皮細胞分泌IL-6、t-PA的影響

陳潤姣，張佳佳，王彥茹，林素蘭，吳蘭華，蔣 睿

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肝素對氟尿嘧啶誘導的人臍靜脈內皮細胞分泌IL-6、t-PA的影響

陳潤姣，張佳佳，王彥茹，林素蘭，吳蘭華，蔣 睿

[目的]探討肝素對氟尿嘧啶(5-FU)誘導的人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)分泌IL-6、t-PA的影響。[方法]實驗分為空白對照組、氟尿嘧啶組、肝素低濃度組、肝素中濃度組和肝素高濃度組，每隔24 h按照分組更換新鮮培養液，分別于孵育的第1天、第5天、第9天、第15天收集各組24 h上清液，采用酶聯免疫吸附雙抗體夾心分析法測定各組細胞上清液中的組織型纖溶酶原激活物(t-PA)和白細胞介素-6(IL-6)的含量。[結果]干預第5天、第9天和第15天，氟尿嘧啶組IL-6和t-PA的濃度與空白對照組比較有所升高(P<0.05)；干預第5天和第15天，高濃度肝素組IL-6、t-PA的分泌量較氟尿嘧啶組降低(P<0.05)。[結論]肝素可降低氟尿嘧啶誘導的人臍靜脈內皮細胞IL-6、t-PA的分泌，對損傷后的血管內皮細胞具有保護作用，肝素濃度以50 U/mL為宜。

肝素；氟尿嘧啶；人臍靜脈內皮細胞；組織型纖溶酶原激活物；白細胞介素-6

經外周靜脈置入中心靜脈導管(peripherally inserted central catheter,PICC)是惡性腫瘤病人化療的理想輸液通路，被臨床廣泛應用。但PICC置管后靜脈炎的發生率可達57.65%，40.7%的病人由于并發癥而不得不提前拔管[1]，影響病人治療方案的實施。PICC會引起血管內膜損傷，受損的內皮細胞將失去其抗血栓作用而導致炎癥反應，炎癥又促進血栓形成，形成惡性循環而導致血管堵塞。有臨床研究表明：在應用套管針和中心靜脈導管時，封管液是保持導管通暢、防止導管阻塞、維持輸液通路的關鍵[2]。因此，正確選擇封管液是減少中心靜脈置管后血管內皮細胞損傷、血栓形成和靜脈炎發生的重要條件。目前臨床應用的封管液不僅種類繁多，劑量也各異。肝素作為一種酸性黏多糖在體內、體外應用時均有強抗凝作用[3]，是臨床常用的封管液之一。但肝素對血管內皮細胞的作用、血栓形成及靜脈炎影響的研究僅限于臨床觀察研究，且說法各異。本研究以體外培養的人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)為研究對象，觀察不同濃度的肝素稀釋液對氟尿嘧啶作用后HUVECs釋放組織型纖溶酶原激活物(t-PA)和白細胞介素-6(IL-6)的影響，探索肝素預防中心靜脈置管致靜脈炎的可能機制，找尋肝素保護內皮細胞的較佳濃度和作用時間。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞、藥物及試劑 HUVECs細胞株購自江陰齊氏生物科技有限公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，RPMI-1640培養基、胰蛋白酶、雙抗均購自美國Hyclone公司，白細胞介素-1(IL-1)、IL-6及t-PA試劑盒均購自武漢優爾生科技股份有限公司，6孔板、96孔板購自美國康寧公司，氟尿嘧啶購自上海旭東海普藥業有限公司、肝素購自北京索萊寶有限公司。

1.1.2 儀器 HF 212UV二氧化碳培養箱、Thermo生物安全柜、Leica CTR6000倒置顯微鏡、酶標儀Mode1680。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將凍存的細胞株復蘇，加入含10%胎牛血清，5%青霉素/鏈霉素的M199培養液，放置于37℃、5%CO2的培養箱中培養，待細胞長至80%～90%融合度時，以0.25%胰蛋白酶消化傳代，2代～3代用于實驗。選擇對數生長期的細胞，調整細胞濃

度為1.0×105cells/mL,接種于96孔板中，每孔200 μL。待細胞生長至80%融合后，貼壁細胞隨機分為5組，每組3個復孔；倒置顯微鏡進行形態學觀察并攝片。

1.2.2 實驗分組 空白對照組：每孔加入200 μL的培養基孵育15 d；氟尿嘧啶組：每孔加入200 μL氟尿嘧啶濃度為25 mg/L的培養基孵育15 d；肝素組：①低濃度組為每孔加入200 μL肝素濃度為12.5 U/mL，氟尿嘧啶濃度為25 mg/L的培養基孵育15 d；②中濃度組為每孔加入200 μL，肝素濃度為25 U/mL，氟尿嘧啶濃度為25 mg/L的培養基孵育14 d；③高濃度組為每孔加入200 μL，肝素濃度為50 U/mL，氟尿嘧啶濃度為25 mg/L的培養基孵育15 d。培養液中每隔24 h加入上述不同濃度的肝素稀釋液，于孵育的第1天、第5天、第9天、第15天收集各組24 h上清液，-80 ℃凍存，待測。

1.2.3 HUVECs的形態觀察 分別于第1天、第5天、第9天、第15天，倒置相差顯微鏡觀察各組HUVECs的形態和數量變化。

1.2.4 酶聯免疫吸附雙抗體夾心法(ELISA)檢測內皮細胞的炎性分子IL-6和t-PA濃度 分別將IL-6及t-PA標準品準確復溶，用稀釋液做1.25次倍比稀釋，IL-6標準品濃度分別為6 ng/L、4 ng/L、2 ng/L、1 ng/L、0.5 ng/L，t-PA標準品濃度分別為12 ng/L、8 ng/L、4 ng/L、2 ng/L、1 ng/L。實驗其余步驟嚴格按IL-6及t-PA蛋白測定試劑盒說明書操作。在450 nm波長處測得A值，以A450對應抗原標準品質量濃度，制作標準曲線，從標準曲線上查出IL-6和t-PA濃度。

2 結果

2.1 HUVECs的形態觀察 在倒置相差顯微鏡觀察用不同方法培養的HUVECs，可見其形態均不規則。空白對照組：HUVECs細胞的數目隨著時間的推移而增多，細胞稀疏呈梭形，隨著數目的增多，細胞密集，呈鋪路石樣外觀，細胞邊界清楚，胞漿豐富，胞核呈圓形或橢圓形，偶見雙核。氟尿嘧啶組: HUVECs細胞的數目隨著時間的推移而減少，細胞的間隙增寬,細胞收縮、變圓，細胞的邊界不清，部分細胞脫落。肝素組：低濃度肝素組為HUVECs細胞的數目隨著時間的推移而減少，細胞呈梭形，細胞邊界清楚，胞漿豐富，胞核呈圓形或橢圓形，偶見雙核；中濃度肝素組為HUVECs細胞的數目隨著時間的推移而減少，細胞形態同低濃度肝素組；高濃度肝素組為HUVECs細胞的數目隨著時間的推移而減少，細胞形態同低濃度肝素組。

2.2 不同培養方法對HUVECs釋放IL-6、t-PA的影響 不同時間3種濃度肝素組IL-6、t-PA分泌量比較差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 不同培養方法對HUVECs釋放IL-6、t-PA濃度的影響 ng/L

3 討論

PICC穿刺過程中執行無菌技術不嚴格、穿刺技術不熟練、同一部位反復穿刺、置管時間過長等因素，可損傷血管內膜或引起細菌感染，導致靜脈炎的發生。靜脈炎可分為機械性、化學性、細菌性及血栓性4種類型，特別是血栓性靜脈炎的發生，輕者可導致提前拔管，嚴重者可因血栓脫落而危及病人生命[4]。因此，正確選擇封管液是減少中心靜脈置管后血管內皮細胞損傷、血栓形成和靜脈炎發生的關鍵。目前，肝素稀釋液是臨床最常用的封管液，用以預防PICC所致并發癥的發生。臨床使用肝素稀釋液封管的最佳濃度眾說不一，差異較大，從1.00 U/mL～250.00 U/mL均有應用[5-6]。本實驗選擇的肝素分為3個濃度組：低濃度肝素組濃度為12.5 U/mL，中濃度肝素組濃度為25 U/mL，高濃度肝素組濃度為50 U/mL。各濃度組均能抑制HUVECs的炎癥反應。

纖溶系統是防止血管內形成的內源性防御機制之一，其主要功能是清除沉淀于血管壁的纖維蛋白，溶解血凝塊，維持血流通暢，防止血栓形成[7]。t-PA是機體纖溶系統重要的組成部分。據文獻報道，t-PA代表了從血管內皮細胞損傷到凝血纖溶激活的血栓前狀態的各個環節，是對血栓前狀態具有較高敏感性和特異性反應的指標[8]。IL-6對于血管炎性病變起著重要的調節作用，IL-6增強內皮細胞黏附能力,還可以增加內皮細胞的通透性，直接損傷內皮細胞。IL-6是一種促炎癥細胞因子，循環中的IL-6是由許多細胞，包括激活的巨噬細胞和淋巴細胞分泌的誘導內皮細胞的趨化因子和粘附因子的表達、釋放[9]。

本研究結果顯示：與氟尿嘧啶組比較，給予肝素干預后第1天和第9天，僅中濃度肝素組IL-6分泌有所降低，而第5天和第15天3種濃度肝素干預后IL-6均降低，提示肝素可通過降低IL-6的分泌抑制靜脈內皮細胞的炎癥反應，對細胞有保護作用。此外，肝素干預后第1天，僅高濃度肝素組t-PA的分泌降低，第9天僅中濃度肝素組t-PA的分泌有所降低，而高濃度肝素組在干預第5天和第15天t-PA的分泌均降低。分析認為氟尿嘧啶干預可能會增加t-PA的分泌量，增加血液的纖溶活性，高濃度肝素干預可抑制t-PA表達，使血液的纖溶活性降低，這與謝莉玲[4]的研究結果(在無禁忌病人中使用10 U/mL肝素稀釋液沖管和封管，可有效預防PICC置管期間血栓靜脈炎的發生)一致。本研究結果還顯示：不同時間3種濃度肝素組比較，IL-6和t-PA的分泌量比較差異無統計學意義(P>0.05)，提示50 U/mL肝素濃度更適用于臨床應用，這與劉玉芹等[10]的結論(腫瘤病人化療時靜脈留置針宜采用肝素鹽水封管，50 U/mL濃度肝素鹽水封管效果較好)一致。

本研究結果顯示：50 U/mL肝素可以降低氟尿嘧啶應用后HUVECs的IL-6、t-PA的分泌，對損傷后的血管內皮細胞可起到保護作用。

[1] 賈永紅,馬玲,賀振民,等.癌癥化療患者發生PICC靜脈炎的相關因素分析及護理對策[J].腫瘤藥學,2013,3(3):236-240.

[2] 廖素霞,蒙好好,鄒艷輝,等.不同劑量肝素臍靜脈導管封管效果比較[J].護理學雜志,2010,25(3):33-35.

[3] 熊輝,鄒樹芳,許芳.3種不同濃度肝素鈉封管效果觀察[J].護理研究,2004,18(6):987.

[4] 謝莉玲.低濃度肝素稀釋液對經外周靜脈置入中心靜脈導管置管期間血栓性靜脈炎的預防效果[J].中華臨床營養雜志,2010,2(18):56-59.

[5] 黃硯屏,林靜.新生兒PICC安全封管液的臨床探討[J].護士進修雜志,2009,5(24):40-41.

[6] 廖曉英.2種靜脈留置針封管液效果比較[J].臨床合理用藥,2010,3(7):43-44.

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[9] 段浩,張宏考,劉繼軍,等.小檗堿對兔頸動脈損傷后白介素-6等的影響[J].醫藥論壇雜志,2006,5(27):6-9.

[10] 劉玉芹,鄭海英,田金枝.肝素鈉用于腫瘤化療患者靜脈留置針封管的效果觀察[J].醫護論壇,2009,16(18):187-188.

(本文編輯崔曉芳)

Influence of heparin on secretion of IL-6 and t-PA of human umbilical vein endothelial cells induced by fluorouracil

Chen Runjiao,Zhang Jiajia,Wang Yanru,etal

(College of Nursing,Xinjiang Medical University，Xinjiang 830000 China)

2014年新疆醫科大學大學生創新項目，編號：CX2014032。

陳潤姣，本科，單位：830000，新疆醫科大學護理學院；張佳佳、王彥茹、林素蘭單位：830000，新疆醫科大學護理學院；吳蘭華單位：830000，新疆醫科大學第一附屬醫院；蔣睿(通訊作者)單位：830002，新疆醫科大學第六附屬醫院。

R47

A

10.3969/j.issn.1009-6493.2016.36.015

1009-6493(2016)12C-4532-03

2016-02-18；

;2016-11-20)

引用信息 陳潤姣，張佳佳，王彥茹，等.肝素對氟尿嘧啶誘導的人臍靜脈內皮細胞分泌IL-6、t-PA的影響[J].護理研究，2016，30(12C)：4532-4534.