ATP熒光檢測儀校準方法研究

李月玥（廣州計量檢測技術研究院，廣州 510030）

ATP熒光檢測儀校準方法研究

李月玥（廣州計量檢測技術研究院，廣州 510030）

ATP熒光檢測儀是現場水質污染及現場環境物體表面細菌負載的快速檢測中逐漸普及的檢驗儀器，在衛生檢測領域中起著重要作用。本文依據ATP熒光檢測儀的工作原理，初步建立一套可靠的校準方法，并對其線性誤差測量不確定度進行分析。

ATP熒光檢測儀；校準方法；測量不確定度

在衛生學評價中，細菌污染檢測是常規監測項目。目前，細菌定量檢測通常采用瓊脂平板計數法，由于其操作復雜，耗費時間長，很難滿足HACCP(Hazard Analysis and Critical Control Point) 體系中微生物污染的在線監測[1]。20世紀80年代，英國首先研制ATP熒光檢測系統，隨后將其應用于檢測微生物和食品殘渣[2]。

1 ATP熒光檢測儀工作原理

ATP熒光檢測儀依據ATP生物發光法的基本原理，即熒光素在熒光素酶催化下，由ATP激活，使之與氧結合，在結合過程中發出熒光[3]。其反應如下圖1所示。當反應中的熒光素-熒光素酶達到飽和反應量時，ATP含量與所釋放的熒光光子量成正比。有研究表明，活細胞數量的對數值與ATP生物熒光值的對數值之間存在良好的線性關系[4]。因此，ATP熒光檢測儀以相對熒光強度（relative light units，RLU）數值表示樣品中ATP的總量，進而反映樣品中活細胞數量。

2 校準方法分析

根據ATP熒光檢測儀的性能和工作原理，認為測量線性誤差及測量重復性是影響其分析結果的主要技術指標，必須進行校準確認。

通過實驗發現，ATP熒光檢測儀的測量結果受工作環境影響，特別是外界ATP干擾、環境溫度，以及測樣時間。因此，在測試時應符合實驗室潔凈無ATP存在，環境溫度在（10 ～30）℃中某一設定溫度值下，測樣時間一致等條件。

根據實際情況，在儀器的量程范圍內取4～5個測量點，使用無ATP超純水和ATP純度標準物質準確配置相應濃度的ATP標準樣品溶液。各測量點取10μL進行檢測，測樣時間為30 s，重復測量3次，取平均值作為測量結果。按線性回歸法求出標準曲線的斜率、截距和線性相關系數。按照公式（1）計算標準曲線測量中間點的誤差，即為儀器的線性誤差。

為了得到儀器的測量重復性，在滿足測試條件的情況下，選取中間測量點重復測量6次（取樣量為10μL，測樣時間為30 s），計算測量結果的相對標準偏差RSD（%），即為儀器的測量重復性。計算公式如下：

3 線性誤差測量不確定度分析

使用一臺性能穩定，量程為（0.01～10.0） fmol的ATP熒光檢測儀，取0.01fmol、0.5 fmol、1.0 fmol、2.0 fmol、5.0 fmol為測量點，采用上述方法進行校準。測量線性誤差的校準數據如表1所示，測量重復性的校準數據如表2所示。

表1 測量線性誤差的校準數據

表2 測量重復性的校準數據

3.1 數學模型

本文中線性誤差的計算方法如公式（1）所示，其數學模型為：

方差：

靈敏系數：

則：

3.2 測量結果的不確定度分析

ATP標準物質的純度≥ 98%，其相對擴展不確定度小于2%（k=2），在2.0 fmol含量下，標準溶液含量的標準不確定度為0.02fmol。

3）合成標準不確定度

4）擴展不確定度

在95%置信概率下取k=2，線性誤差測量結果的擴展不確定度為：

4 結論

目前，關于ATP熒光檢測儀的國家計量校準規范還未公布。本文根據ATP熒光檢測儀的工作原理，提出其測量線性誤差及測量重復性的校準方法，并分析了線性誤差測量不確定度，對ATP熒光檢測儀的計量校準具有重要的參考價值。

[1] Tanaka H, Shinji T, Sawada K, et al. Development and application of a bioluminescence ATP assay method for rapid detection of coliform bacteria[J]. Water Research, 1997, 31(8):1913-1918.

[2] Selan L, Berlutti F, Passariello C, et al. Reliability of a bioluminescence ATP assay for detection of bacteria[J]. Journal of Clinical Microbiology, 1992, 30(7):1739-42.

[3] Mcelroy WD, Deluca MA. Firefly and bacterial luminescence: basic science and applications[J]. Journal of Applied Biochemistry,1983, 5(3):197-209.

[4] 廖如燕,陳胤瑜,華志濤,等.ATP生物熒光檢測法快速檢測水細菌污染的評價[J].旅行醫學科學,2011,(6):5-11.

Calibration Method for ATP Fluorescence Detector

LI Yue-yue
(Guangzhou Institute of Measurement and Testing Technology, Guangzhou 510030, China)

The application of ATP fluorescence detector is more and more universal for the water pollution detection and the bacteria load on the object surface on the spot. It plays an important role in hygiene examination. Areasonable calibration method on the principle of ATP biological fluorescence method is established, and the measuring uncertainty of the linear error is analyzed.

ATP fluorescence detector; calibration method; measurement uncertainty

TH744.16

A

1672-6286(2016)8-0046-4

李月玥（1988-），女，河北保定人。碩士，主要從事化學及生物類儀器計量檢測工作和研究。