計算機輔助設計新型人脂肪酸合酶抑制劑及其抗腫瘤活性

劉詩雨,米婷婷,任建東,范開華,何 菱*

·研究論文·

計算機輔助設計新型人脂肪酸合酶抑制劑及其抗腫瘤活性

劉詩雨1,米婷婷2*,任建東2,范開華2,何 菱1*

(1.四川大學 華西藥學院，四川 成都 610041；2.中國人民解放軍 成都軍區總醫院 藥劑科，四川 成都 610083)

以Orlistat為先導化合物，利用AutoDock進行計算機模擬對接，在對接結果中選擇能量較低的6個結構進行合成與抗腫瘤活性篩選。以orlistat為原料，經2步反應制得芐基(2S,3S,5S)-2-己基-3,5-二羥基十六酸酯(2)；再經4步反應獲得(3S,4S)-3-己基-4-[(S)-2-羥基十三烷基]氧雜環丁烷-2-酮(5);5在EDCI作用下與酸經縮合反應合成了4個計新型人脂肪酸合酶抑制劑(6a～6d)，其中6b～6d為新化合物，其結構經1H NMR，13C NMR 和HR-MS(ESI)表征。體外初步活性測試表明：(S)-1-[(1S,2S)-3-己基-4-氧代氧雜環丁烷-2-基]十三烷-2-煙酸酯(6a)對MDA-MB-231細胞有較好的抑制作用，其IC50為11.72 μmol·mL-1，優于Orlistat(21.5 μmol·mL-1)。

Orlistat;計算機輔助藥物設計;抗腫瘤活性;合成；人脂肪酸合酶抑制劑

隨著人類平均壽命的延長，以及環境的持續惡化，惡性腫瘤已經成為人類生命與健康安全的一大威脅。傳統的化療藥物雖然能對腫瘤細胞起到一定的抑制作用，但因其作用機制等原因，不良反應也較為嚴重；且腫瘤細胞易突變，很容易產生耐藥性。因此，尋找新靶點的抗腫瘤藥物成為了抗腫瘤藥物的一個設計思路。

Scheme 1

Orlistat對人脂肪酸合酶具有抑制作用[1],且Orlistat與人脂肪酸合酶結合的單晶及其結合方式已確定[2]。而人脂肪酸合酶在多種腫瘤細胞內均有較高表達[3-5]，抑制此酶可以誘導腫瘤細胞凋亡[5-7]。根據Orlistat與人脂肪酸合酶的結合單晶可知，四元內酯環是形成Orlistat酰脂肪酸合酶的必須結構，兩條長脂肪鏈則提供結合初期絕大部分的疏水力。因此，我們希望以Orlistat為先導化合物，保留其長脂肪鏈與四元內酯環結構，借助計算機輔助，設計一系列Orlistat衍生物，以期得到抗腫瘤活性較強的化合物。

本研究以Orlistat為原料[4]，經水解，芐溴保護羧基生成芐基(2S,3S,5S)-2-己基-3,5-二羥基十六酸酯(2)；2經選擇性保護5-位羥基生成芐基(2S,3S,5S)-2-己基-3-羥基-5-[(三異丙基硅基)氧基]十六酸酯(3)；3經鈀碳催化氫解與N-苯基-雙三氟甲磺酰亞胺合環生成(3S,4S)-3-己基-4-{(S)-2-[(三異丙基硅基)氧基]十三烷基}氧雜環丁烷-2-酮(4)；4在氟化氫吡啶鹽的作用下脫去硅保護生成(3S,4S)-3-己基-4-[(S)-2-羥基十三烷基]氧雜環丁烷-2-酮(5)；最后5與不同羧酸在EDCI作用下縮合形成新型人脂肪酸合酶抑制劑(6a～6d，Scheme 1)，其中6b～6d 為新化合物，其結構經1H NMR，13C NMR 和HR-MS(ESI)表征。并對化合物2,5及6a～6d的抗腫瘤活性進行了初步探索。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Varian Mercury 400 MHz型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內標);Aglient-6890型質譜儀;分子模擬工作站(聯想深騰1800型服務器，Autodock 4.0，Chimera，Accelrys DS Visualizer 模擬軟件) 。

Orlistat，純度98%，上海笛柏化學品技術有限公司；其余所用試劑均為分析純。

1.2 分子模擬和化合物虛擬篩選

從蛋白質數據庫中下載2PX6.pdb文件作為生物大分子[2]。利用Chimera剝離單晶中的配體，水分子等小分子，使結合空腔暴露出來。采用AutoDock-Tools 1.5.6分別導入配體與大分子文件，并為其添加極性氫與電荷。根據已有單晶中orlistat與人脂肪酸合酶的硫酯酶結構域的結合位置確定模擬計算時格子中心坐標為(13.51，-5.582，27.876)，格子大小為(48 ?×42 ?×54 ?)，格點間距0.375 ?。分子對接運算采用 Lamarckian 遺傳算法(對接循環參數 200，其余參數為默認值)，配體和受體間的結合情況采用半經驗自由能計算方法。具體運算用 Autodock 4.2.6完成。采用分子對接算法模擬化合物與人脂肪酸合酶的結合模式與能量。在模擬計算的配體數據庫中選取結合能量較低的化合物進行合成，并進行體外抗腫瘤活性篩選。

1.3 合成

(1) 2的合成[6]

(2) 3的合成[6]

氮氣保護下，在反應瓶中加入2 1.35 g(2.82 mmol)和無水DCM 31 mL，冷卻至-78 ℃，攪拌下加入2,4,6-三甲基吡啶0.95 mL和TIPSOTf 1.2 mL，加畢，于-78 ℃反應3 h。加水淬滅反應，用DCM萃取4次，合并有機相，依次用1 mol·mL-1鹽酸和飽和氯化鈉溶液洗滌，無水Na2SO4干燥，過濾，濾液濃縮得無色油狀粗產物，經硅膠柱層析(洗脫劑：A=20/1)純化得無色油狀液體3 1.73 g，產率95.6%；1H NMRδ:7.36～7.31(m,5H),5.08(s,2H),4.85(d,J=4.0 Hz,1H),4.03～4.02(m,1H),3.64～3.61(m,1H),2.39～2.37(m,1H),1.55～1.13(m,35H),1.05～0.91(m,18H),0.86～0.81(m,6H)。

(3) 4的合成[6]

向100 mL燒瓶中加入3 1.73 g(2.79 mmol)，10%無水鈀碳300 mg與無水乙酸乙酯15 mL，攪拌下于常溫常壓進行氫解。抽濾，濾液濃縮得無色油狀物中間體，加入無水DCM 25 mL和TEA 0.77 mL，攪拌下加入PhNTf21.5 g，氮氣保護下于室溫反應過夜。濃縮，殘余物經硅膠柱層析[洗脫劑：V(石油醚)：V(二氯甲烷)=6：1]純化得無色油狀液體4 0.90 g，產率63.2%；1H NMRδ:4.50～4.47(m,1H),3.99～3.97(m,1H),3.28～3.24(m,1H),2.10～1.26(m,35H),1.06(m,18H),0.89～0.87(m,6H)。

(4) 5的合成[6]

在塑料反應器中加入4 750 mg(1.47 mmol)，無水THF 12.5 mL，攪拌下于5～10 ℃加入HF-Py (65～70%) 1.02 g，緩慢升至室溫，反應過夜。加水淬滅反應，用乙酸乙酯萃取，合并有機相，用無水Na2SO4干燥。抽濾，濾液濃縮，殘余物經經硅膠柱層析(洗脫劑：A=7/1)純化得白色石蠟狀固體5 380 mg，產率73.1%；1H NMRδ:4.49～4.45(m,1H),3.82～3.77(m,1H),3.34～3.29(m,1H),2.06～1.23(m,33H),0.89～0.87(m,6H)。

(5) 6a～6d的合成(以6a為例[5])

隨著國網供電公司對于智能化電網工作的不斷推進以及新型電力營銷方法的普及，對電網智能化和精細化管理要求越來越高。為滿足國網供電公司營配業務的高效運行，滿足配電網維修、搶修效率的要求，實現以“標準規范先行、數據治理和應用融合并重、應用建設促功能實用化”的工作思路，重點推進營配業務數據的整理、錄入、核實以及信息化采集系統適用性改造等工作，清理原始數據，規范新增數據；同時也為提高居民低壓集抄系統建設小區的臺區線損率計算準確性，研發和推廣適應新形勢下電網建設和電網精細化管理的新一代全數字化、多功能、智能化臺區識別儀，可以滿足電網建設和管理需要，為實現臺區精細化管理提供真實準確的基礎數據[2]。

在反應瓶中加入5 30 mg(0.084 6 mmol)，EDCI 33 mg，DMAP 21 mg，煙酸21 mg和無水DCM 3 mL，氮氣保護下于室溫攪拌反應過夜。經經硅膠柱層析(洗脫劑 ：A=9/1)純化得6a。

用類似的方法合成6b～6d。

6a：無色油狀液體，收率84.8%;1H NMRδ:9.29(br s,1H),8.87(br s,1H),8.65(d,J=7.6 Hz,1H),7.74(br s,1H),5.38～5.36(m,1H),4.41～4.37(m,1H),3.28～3.24(m,1H),2.34～1.26(m,32H),0.89～0.87(m,6H)。

6b：無色油狀液體，收率86.5%；1H NMRδ:6.44(dd,J=1.2 Hz,17.4 Hz,1H),6.15(dd,J=10.4 Hz,17.4 Hz,1H),5.88(dd,J=1.2 Hz,17.4 Hz,1H),5.09～5.03(m,1H),4.36～4.31(m,1H),3.25～3.19(m,1H),2.26～1.25(m,32H),0.89～0.86(m,6H)；13C NMRδ:171.05,165.69,131.12,128.39,74.68,71.27,56.97,38.68,34.15,31.93,31.47,29.63,29.54,29.46,29.35,28.97,27.69,26.69,25.26,22.70,22.51,14.11,14.01；HR-MS(ESI)m/z:Calcd for C25H44O4{[M+H]+}409.324 0,found 409.331 2。

6c：無色油狀液體，收率73.0%；1H NMRδ:7.71(d,J=16.0 Hz,1H),7.55～7.53(m,2H),7.41～7.39(m,3H),6.45(d,J=16.0 Hz,1H),5.13～5.11(m,1H),4.41～4.36(m,1H),3.27～3.22(m,1H),2.30～1.25(m,32H),0.89～0.83(m,6H)；13C NMRδ:171.12,166.41,145.27,134.17,130.42,128.87,128.08,117.72,74.68,71.06,56.85,38.64,34.18,31.85,31.42,29.57,29.49,29.41,29.31,28.94,27.64,26.66,25.25,22.63,22.45,14.08,13.96；HR-MS(ESI)m/z:Calcd for C31H49O4{[M+H]+} 485.363 1,found 485.364 2。

6d：無色油狀液體，收率76.1%；1H NMRδ:8.071(brs,1H),7.63(d,J=8.0 Hz,1H),7.37(d,J=8.0 Hz,1H),7.22～7.18(m,2H),7.15～7.11(m,1H),4.99～4.97(m,1H),4.15～4.10(m,1H),3.77(s,2H),3.10～3.06(m,1H),2.14～1.20(m,32H),0.89～0.86(m,6H);13C NMRδ:171.63,171.26,136.07,127.03,123.04,122.20,119.64,118.72,111.21,108.21,74.71,71.32,56.61,38.48,34.05,31.86,31.61,31.39,29.57,29.47,29.39,29.30,29.25,28.85,27.42,26.50,25.16,22.64,22.48,14.08,13.99；HR-MS(ESI)m/z:Calcd for C32H50NO4{[M+H]+} 512.374 0,found 512.373 3。

1.4 抗腫瘤活性測定

乳腺癌細胞系MDA-MB-231在含有10%胎牛血清，42 mmol·L-1谷氨酰胺，1 mmol·L-1丙酮酸鈉，100 μg·mL-1青霉素，100 μg·mL-1鏈霉素和0.25 μg·mL-1兩性霉素的DMEM培養基中常規培養。培養物于37 ℃的溫度下維持在5%CO2。細胞被接種在含有10%胎牛血清的DMED培養基的24孔板培養板上，接種密度為每孔20 000個。然后將細胞用Orlistat衍生物在0.01 mmol·L-1至1 nmol·L-1間的5種不同的劑量范圍培養5 d。等體積的DMSO被用作空白對照。利用細胞數與細胞活力分析儀(Beckman Coulter公司)進行計數。以藥物處理過的細胞存活數除以空白對照的細胞存活數計算細胞存活百分比。從試驗化合物的劑量-存活比曲線計算的IC50。

2 結果與討論

2.1 計算機模擬對接

分子模擬與實驗結果產生偏差的原因主要有：(一)由于AutoDock的模擬計算是以配體已經進入大分子的特定區域為前提進行對接，因此對由于分子大小或理化性質等原因造成配體難以進入該區域與大分子結合的化合物將產生較大偏差；(二)本次計算使用的是剛性大分子，無法對配體-受體間的誘導契合效應進行模擬與評價；(三)AutoDock本身計算精度有限，且模擬對接時使用的是去除水分子的大分子模型，因此模擬對接會與真實的配體-受體的接合過程存在差異；(四)AutoDock的模擬對接是以可逆吸附為前提計算的，因此對共價藥物會出現一定的偏差。

圖1 6a與6d的對接結果

如圖1所示，6a的吡啶環結構可以與TYR2343的苯環形成π—π堆積，其四元內酯環的羰基氧可以與SER2308和HIS2481兩個氨基酸殘基形成氫鍵并將四元內酯環固定在SER2308附近，使其與orlistat酰脂肪酸合酶的結構更加接近，更容易形成共價鍵[2]。

與6a的作用類似，6d結構中吲哚乙酸的羰基氧與TYR2343形成氫鍵，且四元內酯環的羰基氧與HIS2481形成氫鍵。增加了6d與脂肪酸合酶的結合力。以上因素可能是6a與6d活性較高的原因。

2.2 抗腫瘤活性

為了驗證模擬對接結果，我們以MDA-MB-231腫瘤細胞為模型，測試各化合物對該腫瘤細胞的IC50值，結果見表1。由表1可見，6a和6d對MDA-MB-231細胞的抑制活性明顯優于Orlistat。尤其是6a(IC50=11.72 μmol·mL-1)。可看出當R含氮芳香雜環結構時其抗腫瘤作用較好，為以后相關研究奠定了基礎。

表1 化合物的抗腫瘤活性

*μmol·mL-1。

3 結論

通過計算機輔助設計，以Orlistat為原料經水解保護、關環、脫保護及酯化等步驟反應合成了6個新型人脂肪酸合酶抑制劑(2、5、6a～6d) ，其中6b～6d為新化合物。體外活性測試表明：(S)-1-[(1S,2S)-3-己基-4-氧代氧雜環丁烷-2-基]十三烷-2-煙酸酯(6a)對MDA-MB-231細胞有較好的抑制活性，其IC50為11.72 μmol·mL-1，優于Orlistat (21.5 μmol·mL-1)。說明基于人脂肪酸合酶的計算機模擬結果與該化合物對腫瘤細胞的抑制活性是相關的。

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Computer Aided Design of Novel Human Fatty Acid Synthase Inhibitors and Their Antitumor Activities

LIU Shi-yu1, MI Ting-ting2*, REN Jian-dong2, FAN Kai-hua2, HE Ling1*

(1.West China School of Pharmacy,Sichuan University，Chengdu 610041,China； 2.Pharmaceutical Preparation Section of Chengdu Military General Hospital，Chengdu 610083,China)

With orlistat as the pilot，six compounds with low-energy structures were chosen by computer stimulation for further synthesis and a ntineoplastic activity screening using AutoDock.Benzyl (2S,3S,5S)-2-hexyl-3,5-dihydroxyhexadecanoate(2) was prepared by two steps of reaction from Orlistat.(3S,4S)-3-hexyl-4-[(S)-2-hydroxytridecyl]oxetan-2-one(5) was prepared by four steps of reaction from 2.Human fatty acid synthase inhibitors(6a～6d) were obtained from 5 by condensation reaction with corresponding acid in the presence of EDCI,Among them 6b～6d were novel compounds.The structures were characterized by1H NMR,13C NMR and HR-MS(ESI).Invitrotest results showed that(S)-1-[(2S,3S)-3-hexyl-4-oxooxetan-2-yl]tridecan-2-yl nicotinate(6a) exhibited better inhibitory activity againstfattyacidsynthasewith IC50of 11.72 μmol·mL-1,which is better than Orlistat (21.5 μmol·mL-1).

Orlistat;computer-aided drug design;antineoplastic；synthesis;human fatty acid synthase Inhibitor

2016-03-28；

2016-09-23

國家自然科學基金資助項目(21072131)；四川省科技廳科技支撐計劃資助項目(2015SZ0168)

劉詩雨(1989-)，男，漢族，河北唐山人，碩士，主要從事藥物化學的研究。 E-mail:470558926@qq.com

何菱，教授，Tel.028-85503365,E-mail:lhe2001@sina.com.cn；米婷婷，主管藥師，E-mail:miting85@163.com

O621.3

A

10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2016.12.16086