提取油茶籽抗氧化活性物質的研究

◎ 曾麗珠，李 軒，張 昊

（陽江出入境檢驗檢疫局，廣東 陽江 529500）

提取油茶籽抗氧化活性物質的研究

◎ 曾麗珠，李 軒，張 昊

（陽江出入境檢驗檢疫局，廣東 陽江 529500）

本文選用石油醚（弱極性）、乙酸乙酯（中等極性）、正丁醇（強極性）三種不同萃取劑分離提取油茶籽中的抗氧化物，測定和比較不同萃取層的總酚含量、清除DPPH自由基活性和還原能力發現，活性較強部分主要分布在中等極性的乙酸乙酯層。取抗氧化活性最強的乙酸乙酯層萃取物用乙酸乙酯∶甲醇梯度洗脫劑過柱，發現抗氧化活性部分主要富集于9∶1段和6∶4段。相比于市售茶油，亞臨界茶油含有更多的有效抗氧化成分并具有更好的抗氧化效果。

提取；油茶籽；抗氧化活性

1 研究背景

1.1 油茶籽的應用價值

油茶（Camellia oleifera Abe1）隸屬于山茶科（Theacese）山茶屬（Camellia L），是我國特有的食用油料樹種，脂肪酸組成與在西方被譽為“液體黃金”的橄欖油相似，長期食用茶油，具有預防心腦血管疾病、抗肝炎、抗衰老、防癌抗癌等功效。而油茶籽油具有多種功效，歸功于其含有多種功能性成分，如角鯊烯、茶多酚、山茶皂甙、山茶甙等活性物質[1]。

目前，國內外使用較多的是合成抗氧化劑，如沒食子酸丙酯（PG）、二叔丁基羥基甲苯（BHT）、叔丁基對苯二酚（TBHQ）或丁基羥基茴香醚（BTA）等[2]，但隨著人們食品安全意識的提高，對合成添加劑的添加提出了質疑。從油茶籽中提取出高效安全低毒的抗氧化活性物質，成為進一步開發天然高效食品抗氧化劑的重要途徑。

1.2 亞臨界萃取技術的應用

傳統的油茶籽油的提取工藝主要有壓榨法、有機溶劑浸提法、水蒸氣蒸餾法、油脂分離法等，新型的提取工藝則有超臨界萃取法[3]和亞臨界萃取，顯然前幾種的提取方法都會一定程度上影響茶油的成率和品質，超臨界CO2提取茶籽油盡管產品質量好、得率高，但設備要求高，一次性資金投入較大。而亞臨界萃取作為其中一種新型提取工藝，有著條件相對溫和，對高壓設備要求不苛刻和成本更低的優點。

1.3 研究的目的與意義

本文通過提取油茶籽中不同極性物質，對不同極性的萃取物質進行總酚含量的測定，并利用油茶籽油中不同極性萃取物進行自由基清除能力試驗，初步探明不同極性酚類物質的抗氧化能力和清除自由基的效果，有利于有針對性地分離、提取活性物質。在發現油茶籽中含有中等極性的抗氧化活性成分的基礎上，進一步研究亞臨界茶油的抗氧化活性，從而為論證亞臨界茶油的高品質奠定基礎。

2 材料與方法

2.1 材料與設備

油茶籽；油茶籽醇提物：自制（油茶籽經挑選后熱風干燥，用70%乙醇，在35 ℃下提取30 min，料液比1∶30，減壓濃縮真空干燥，密閉、低溫保存備用）；市售茶油、亞臨界茶油，參數選擇：原料堆密度0.7 kg/L，萃取時間70 min，萃取壓力0.5 MPa，萃取溫度45 ℃，顆粒度10目，亞臨界丁烷；沒食子酸（GA）標準品；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼；三氯乙酸。

鼓風干燥箱，旋轉蒸發儀，真空泵，超聲清洗器，、數顯恒溫水浴箱，棱光紫外分光光度計，中藥粉碎機。

2.2 實驗方法

（1）油茶籽醇提物的分級萃取。稱取一定量的油茶籽醇提物，用水配制成懸浮液，依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇分別萃取3次。各不同極性的萃取液合并后用旋轉蒸發儀減壓濃縮至干粉，即得到分級萃取各相，分別為石油醚相、乙酸乙酯相，正丁醇相及水分級相。

（2）油茶籽醇提物及其各分級萃取相的總酚含量測定。標準曲線的制定：準確稱取真空干燥至恒重的沒食子酸標準品44.3 mg，用水溶解并定容至100 mL。以此溶液配成濃度為8.86、17.72、35.44、70.88 μg/mL和88.60 μg/mL的溶液。分別取上述不同溶液1 mL加到10 mL比色管中，依次加入1 mL去離子水，0.5 mL已稀釋2倍的福林-酚試液，1.5 mL 26.7%Na2CO3溶液，最后用水定容至10 mL，室溫下反應2 h，在760 nm下測定其吸光度。由吸光度對濃度進行回歸分析，繪制標準曲線。試樣的測定：準確稱取適量試樣，用水溶解，濃度在0.08 mg/mL左右。取1 mL樣品液加到10 mL比色管中，測得的吸光度代入標準曲線，求得試樣中總多酚的含量。

（3）清除DPPH自由基活性的測定。試樣的測定：分別將各相萃取物提取液4 mL和2×10-4mo1/L DPPH溶液1 mL加入同一具塞試管中搖勻，在室溫下密閉靜置30 min，用純溶劑甲醇作參比液，于517 nm波長下測定吸光度。根據公式（1）計算每種提取液對DPPH自由基的清除率。

其中，As為加4 mL提取液后DPPH溶液的吸光度；Asb為4 mL提取液+1 mL溶劑（甲醇）后的吸光度；Ac為4 mL溶劑（甲醇）+1 mLDPPH溶液的吸光度。

（4）還原能力的測定。在2.5 mL pH=6.6的磷酸鹽緩沖液中加入不同濃度的試樣液2.5 mL，1%的鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混合物在50 ℃恒溫20 min后，再加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，然后以3 000 r/min離心分離10 min，取上層清液5 mL加蒸餾水5 mL和0.1% FeC13溶液1 mL，在700nm處測定吸光度，即為OD值。吸光度越高，還原能力越強。

3 結果與分析

3.1 油茶籽醇提物不同萃取層中總酚含量

以標準沒食子酸濃度（x）為橫坐標，吸光度（y）為縱坐標，繪制標準曲線，用最小二乘法進行線性回歸分析得標準回歸方程為y=0.007 9x+0.045 6，線性相關系數R2=0.9961。利用沒食子酸濃度與吸光值的關系標準曲線圖，可根據吸光值推測定試樣的沒食子酸濃度。在堿性溶液中，顏色的深淺與多酚含量呈正相關，藍色化合物在760 nm處有最大吸收。一般用沒食子酸（或焦性沒食子酸）作為參照標準。提取物中總多酚的含量以等同于沒食子酸的量表示。

取各不同極性的干粉，配置成相同濃度，利用沒食子酸標準曲線測定其中總酚含量，總酚含量大小依次為：正丁醇＞乙酸乙酯＞水層＞石油醚層。

3.2 油茶籽醇提取物不同萃取層清除DPPH自由基活性

相同濃度下，不同萃取層清除DPPH自由基活性的能力不同，自由基清除能力大小依次為：乙酸乙酯＞正丁醇＞水層＞石油醚層。在所測濃度內，乙酸乙酯層表現出較強的自由基清除能力。

3.3 油茶籽醇提取物不同萃取層還原能力

各萃取層樣品反應后的生成物在700 nm下的吸光度大小，可反映出物質抗氧化能力的強弱。OD值由大到小依次為：乙酸乙酯＞正丁醇＞水層＞石油醚層。結合以上三點可知，油茶籽醇提取物中不同萃取層的還原能力、DPPH清除率與酚類含量呈正相關關系。

3.4 乙酸乙酯層柱層析后抗氧化活性比較

取乙酸乙酯層萃取物，過100～200目硅膠柱，以乙酸乙酯∶甲醇進行梯度洗脫，洗脫比例分別為：10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4和5∶5（極性依次增加）。每個梯度洗脫3倍柱體積，分段收集，以自由基清除率和還原能力為評價指標進行檢測。以自由基的清除率為比較指標得出：6∶4＞9∶1＞油茶籽醇提取物＞10∶0＞7∶3＞8∶2＞5∶5。以還原能力為比較指標：9∶1＞油茶籽醇提取物＞6∶4＞10∶0＞7∶3＞5∶5＞8∶2。結果進一步論證了油茶籽中抗氧化成分的存在及其極性大小。

3.5 亞臨界茶油與市售茶油的自由基清除能力比較

市售茶油和亞臨界茶油均有清除DPPH自由基的能力，且清除能力與樣品的濃度呈現正相關關系，隨著樣品濃度的增大其清除能力也越大。但隨著濃度的增加，亞臨界茶油的自由基清除能力明顯高于市售茶油，這可能與其含有較多的有效抗氧化成分有關。

4 結語

油茶籽中含有抗氧化活性成分。利用活性跟蹤方法發現，對油茶籽醇提取物進行分級萃取，其活性較強的部分集中在乙酸乙酯層，過柱后活性部位主要富集在9∶1和6∶4，且初步研究得出亞臨界茶油的自由基清除率優于市售精煉茶油。

[1]毛方華，王鴻飛，劉 飛等.茶籽油的提取及其對自由基清除作用的研究[J].西北林學院學報，2009（5）：125-128.

[2]董新榮，劉宇光，李本祥.芝麻酚對茶油抗氧化活性研究[J].食品研究與開發，2008（7）：19-21.

[3]李川山，陳 曄.植物精油提取工藝研究進展[J].大眾科技，2010（9）：86-87.

The Research about the Antioxidant Activity of Tea Seed

Zeng Lizhu, Li Xuan, Zhang Hao
(Yangjiang Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Yangjiang 529500, China)

The antioxidant activities of tea seed were separated and extracted by three different kinds of extracting agent—petroleum ether (low-polar), ethyl acetate (middle-polar) and lsobutanol (strong-polarity), the stronger active part was mainly distributed in the ethyl acetate layer of middle-polar through measuring and comparing the content of total polyphenol, DPPH radical scavenging rate and reductive ability from different extraction layer. The strongest antioxidant activity extraction from ethyl acetate layer was elutinged by the gradient elution liquid of ethyl acetate：methanol, the activity part was mainly occurred in 9：1and 6：4. Compared to the tea seed oil on sale, sub-critical tea seed oil had more effective antioxidant content and better antioxidant eff ect.

Extract; Tea seed; Antioxidant activity

10.16736/j.cnki.cn41-1434/ts.2016.20.038

TS229