新生血管性青光眼患者血清及房水血管內(nèi)皮生長因子與促紅細胞生成素的表達研究

謝 靜，王 輝，袁思奇，羅耀玲

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·論著·

新生血管性青光眼患者血清及房水血管內(nèi)皮生長因子與促紅細胞生成素的表達研究

謝 靜，王 輝，袁思奇，羅耀玲

目的 探究新生血管性青光眼(NVG)患者血清及房水血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、促紅細胞生成素(EPO)的表達情況。方法 選取2013年在贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院就診并住院治療的NVG患者20例(A組)、原發(fā)性青光眼患者20例(B組)及白內(nèi)障患者20例(C組)。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測3組患者血清及房水VEGF、EPO水平；采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)檢測3組患者血清VEGF、EPO mRNA水平。結(jié)果 3組患者血清EPO水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；B組、C組血清VEGF水平及房水VEGF、EPO水平低于A組(P<0.05)；C組血清VEGF水平及房水VEGF、EPO水平低于B組(P<0.05)。NVG患者血清及房水中VEGF水平與EPO水平均無直線相關(guān)關(guān)系(r值分別為-0.274、-0.182，P>0.05)。B組、C組血清VEGF mRNA水平均低于A組(P<0.05)；C組血清VEGF mRNA水平均低于B組(P<0.05)；3組患者血清EPO mRNA水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 NVG患者房水中VEGF、EPO水平均較高，而血清及房水中VEGF、EPO水平無直線相關(guān)關(guān)系，提示VEGF、EPO在NVG的發(fā)病機制中可能是相互獨立的因素。

青光眼,新生血管性；血管內(nèi)皮生長因子A；紅細胞生成素；血清；眼房水

謝靜，王輝，袁思奇，等.新生血管性青光眼患者血清及房水血管內(nèi)皮生長因子與促紅細胞生成素的表達研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2016，19(33)：4073-4078.[www.chinagp.net]

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新生血管性青光眼(nonvascular glaucoma，NVG)是一種常見的繼發(fā)性青光眼，隨著視網(wǎng)膜靜脈阻塞、視網(wǎng)膜缺血綜合征及糖尿病性視網(wǎng)膜病變等缺血性疾病發(fā)病率逐年上升，NVG發(fā)病率也呈上升趨勢[1]。NVG病因較復(fù)雜、治療難度較大，如不及時處理將會給患者的視力帶來嚴重損傷。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前發(fā)現(xiàn)的最強內(nèi)皮細胞選擇性促有絲分裂因子和血管生成因子，在新生血管形成過程中具有特異性刺激血管內(nèi)皮細胞增殖的作用。促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)是一種來源于成人腎臟及胎兒肝臟的含唾液酸的酸性熱穩(wěn)定(80 ℃)糖蛋白，同時也是生成正常紅細胞所必需的激素。在缺氧狀態(tài)下，EPO最容易被激活，其是低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducable factor-1，HIF-1)首次識別的目標[1-2]。本研究觀察了NVG患者血液及房水VEGF、EPO的表達水平，旨在為NVG的早期診斷及防治提供臨床依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年在贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院就診并住院治療的NVG患者20例(A組)、原發(fā)性青光眼患者20例(B組)及白內(nèi)障患者20例(C組)。A組的納入標準：(1)眼壓>21 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)；(2)虹膜表面經(jīng)裂隙燈顯微鏡、前房角鏡等檢查可見新生血管，常規(guī)降眼壓藥物治療無效；(3)既往有眼底出血病史，包括糖尿病性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞和視網(wǎng)膜缺血綜合征等；(4)藥物控制不滿意但仍有視力者。B組的納入標準：(1)原發(fā)性開角型青光眼患者：房角為開角，眼壓>21 mm Hg，視野檢查發(fā)現(xiàn)存在一定程度的青光眼性視野損害，視神經(jīng)纖維層缺損，杯盤比(C/D)>0.5；(2)原發(fā)性閉角型青光眼(PACG)患者：房角狹窄、高眼壓狀態(tài)下房角關(guān)閉，眼壓>21 mm Hg，視野檢查發(fā)現(xiàn)存在一定程度的青光眼性視野損害，典型視神經(jīng)盤凹陷擴大、盤沿面積丟失、視神經(jīng)纖維層缺損，C/D>0.5；(3)經(jīng)藥物治療后仍有進行性青光眼損害；(4)目前需要進行抗青光眼手術(shù)治療。C組的納入標準：(1)年齡>50歲，雙眼先后發(fā)??；(2)漸進性、無痛性視力減退；(3)晶狀體皮質(zhì)和/或核部或/和后囊下混濁。3組患者全身狀況良好，均無全身系統(tǒng)性疾病，均無青光眼相關(guān)手術(shù)或激光治療史。3組患者性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；3組患者眼壓比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

表1 3組患者一般資料比較Table 1 Comparison of general data among 3 groups

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 血清樣本采集：取患者清晨靜息狀態(tài)下空腹肘靜脈血3～4 ml，4 ℃下2 000 r/min離心10 min(離心半徑為5.4 cm)，取上清液0.3～0.4 ml至無菌Eppendof管內(nèi)，做好序號標記后放入-70 ℃超低溫冰箱中保存待檢。房水樣本采集：患者進入手術(shù)室后平躺于手術(shù)臺上，沖洗結(jié)膜囊，常規(guī)消毒、鋪巾，根據(jù)患者具體情況選擇全身麻醉或球后麻醉(2%利多卡因與0.75%布比卡因等量混合后，3.5 ml球后注射麻醉)，貼眼科皮膚保護膜，采用眼瞼撐開器撐開眼瞼，用1 ml注射器(25號針頭)從角膜緣進入前房，抽取0.15～0.20 ml房水后立即置入0.5 ml無菌Eppendof管內(nèi)，做好序號標記后放入-70 ℃超低溫冰箱中保存待檢。

1.2.2 血清、房水VEGF、EPO水平檢測 從冰箱中取出待檢樣本室溫靜置10 min。人VEGF、EPO的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒均購自美國RD公司。按照人VEGF ELISA試劑盒說明書將標準品按一定比例稀釋，加樣混勻后編號，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37 ℃溫育30 min，再用稀釋好的洗滌液洗板5次，甩干。再在各孔中加入酶標試劑50 μl，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37 ℃溫育30 min，再用稀釋好的洗滌液洗板5次，甩干。加入四甲基聯(lián)苯胺(TMB)50 μl，37 ℃恒溫箱內(nèi)避光反應(yīng)15 min后加入終止液50 μl。采用酶標儀在450 nm處測定吸光度(OD值)，即VEGF水平。EPO水平的檢測步驟同上。

1.2.3 血液樣本中總RNA的制備及鑒定 取新鮮抗凝血2 ml，與磷酸鹽緩沖液(PBS)1∶1混勻后加入4 ml的人外周血淋巴細胞分離液的液面上，離心(2 000 r/min，4 ℃)20 min(離心半徑為5.4 cm)，收集第二層細胞放入含有4～5 ml PBS的試管中，充分混勻后離心(1 500 r/min，4 ℃)5 min(離心半徑為5.4 cm)，去除上清液，沉淀、洗滌。將所獲得淋巴細胞加入1 ml Trizol，用槍頭反復(fù)吹打分散均勻，室溫靜置5 min后充分裂解。按每毫升Trizol加入0.2 ml三氯甲烷，vortex混勻或猛烈晃動離心(12 000 r/min，4 ℃)15 min(離心半徑為5.4 cm)后得總RNAs。提取RNA溶于焦碳酸二乙脂(DEPC)處理水(10～20 μl)，-70 ℃保存。采用紫外線分光光度法測定RNA的純度和濃度，采用凝膠電泳檢測RNA的完整性。引物設(shè)計由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，VEGF上游引物：5′-CGAAGTGGTGAAGTTCATGGATG-3′，下游引物：5′-TTCTGTATCAGTCTTTCCTGGTGAG-3′；EPO上游引物：5′-CGAAGTGGTGAAGTTCATGGATG-3′，下游引物：5′-TTCTGT ATCAGTCTTTCCTGGTGAG-3′；內(nèi)參β-actin上游引物：5′-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游引物：5′-TGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′。

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)檢測VEGF、EPO mRNA水平 模板cDNA 2 μl，上游引物 1 μl，下游引物1 μl，2×Master mix 10 μl，雙蒸水(ddH2O) 6 μl，共20 μl。擴增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，延伸45 s，共33個循環(huán)，最后72 ℃再延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μl PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠上進行電泳，同時以DNA Marker為參照，電泳儀為北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-8型電泳儀，電壓為100 V，電泳45 min。在UVP GELDOT-IT300凝膠成像儀上觀察結(jié)果，并利用vision Works LS 軟件進行灰度掃描，試驗重復(fù)3次。結(jié)果以VEGF/β-actin或EPO/β-actin的相對灰度值比值表示，即VEGF、EPO mRNA水平。

2 結(jié)果

2.1 3組患者血清、房水VEGF、EPO水平比較 3組患者血清EPO水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；3組患者血清VEGF水平及房水VEGF、EPO水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中B組、C組血清VEGF水平及房水VEGF、EPO水平低于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；C組血清VEGF水平及房水VEGF、EPO水平低于B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

2.2 NVG患者血清及房水中VEGF、EPO水平的相關(guān)性分析 NVG患者血清及房水中VEGF水平與EPO水平均無直線相關(guān)關(guān)系(r值分別為-0.274、-0.182，P>0.05)。

2.3 3組患者血清VEGF、EPO電泳圖 VEGF擴增產(chǎn)物在404 bp處出現(xiàn)條帶，EPO擴增產(chǎn)物在123 bp處出現(xiàn)條帶，內(nèi)參β-actin擴增產(chǎn)物在434 bp處出現(xiàn)條帶(見圖1～3)。

2.4 3組患者血清VEGF、EPO mRNA水平比較 3組患者血清VEGF mRNA水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；B組、C組血清VEGF mRNA水平均低于A組，C組血清VEGF mRNA水平低于B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；3組患者血清EPO mRNA水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表3)。

表2 3組患者血清、房水VEGF、EPO水平比較Table 2 Comparison of serum and aqueous humor levels of VEGF and EPO among 3 groups

注：VEGF=血管內(nèi)皮生長因子，M=Marker

圖1 3組患者血清中VEGF表達的電泳圖

Figure 1 Electrophoresis of VEGF expression in serum of 3 groups

注：EPO=促紅細胞生成素

圖2 3組患者血清中EPO表達的電泳圖

Figure 2 Electrophoregram of EPO expression in serum of 3 groups

圖3 3組患者血清中β-actin表達的電泳圖

Figure 3 Electrophoregram of β-actin expression in serum of 3 groups

表3 3組患者血清VEGF、EPO mRNA水平比較Table 3 Comparison of expression levels of VEGF and EPO mRNA among 3 groups

3 討論

NVG是由于虹膜表面及前房角新生血管生成，使得小梁網(wǎng)和周邊的虹膜組織互相粘連，引起眼球內(nèi)眼壓升高而出現(xiàn)的一種常見的繼發(fā)性青光眼。NVG的病理過程是眼部在缺血、缺氧或炎癥的反復(fù)刺激下，纖維結(jié)締組織在前房及虹膜內(nèi)生長同時伴有新生血管的形成，且病變的進一步發(fā)展會使得小梁網(wǎng)發(fā)生粘連，阻塞房水的流出通道，導(dǎo)致眼壓的升高。視網(wǎng)膜的缺血、缺氧在高眼壓的狀態(tài)下繼續(xù)加重，刺激新生血管形成，從而使得視神經(jīng)和視功能受到影響，加重視力損害，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。相關(guān)研究表明，隨著我國老齡化進程的不斷加劇，NVG發(fā)病率亦不斷上升[3]。NVG常繼發(fā)于視網(wǎng)膜靜脈阻塞、糖尿病性視網(wǎng)膜病變及視網(wǎng)膜缺血綜合征等疾病，其中增殖型糖尿病視網(wǎng)膜病變中約有1%～17%的患者發(fā)生NVG，主要原因與糖尿病視網(wǎng)膜病變及視網(wǎng)膜缺氧有關(guān)[4]。盡管對NVG中虹膜新生血管的病因仍不十分清楚，但多數(shù)學(xué)者對視網(wǎng)膜缺氧導(dǎo)致的新生血管的觀點較為認同[5-7]。

目前研究表明，新生血管的產(chǎn)生和成熟是一個非常復(fù)雜的過程[8]，需要大量與血管相關(guān)的各種細胞因子共同作用，而VEGF在血管生成的病理生理機制中有著較為關(guān)鍵的限速步驟[9]，也是目前所發(fā)現(xiàn)的最強、最直接的血管形成促進因子[10]。大量研究證明，在低氧狀態(tài)下，缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducing factor-1，HIF-1)被認為是VEGF的主要調(diào)控因子之一的原因是由于其活化了VEGF基因的轉(zhuǎn)錄并增加VEGF mRNA的穩(wěn)定性，達到上調(diào)VEGF基因表達的效果[11]，在低氧狀態(tài)下的各種病理生理環(huán)境中可誘導(dǎo)VEGF mRNA表達，在與VEGF親和力不變的情況下使VEGF受體數(shù)量增加了50%[12]。

本研究結(jié)果顯示，NVG患者血清、房水中VEGF水平高于原發(fā)性青光眼、白內(nèi)障患者，與李莉等[13]、TRIPATHI等[14]研究結(jié)果相近，推測血清、房水中VEGF大量增加可能與NVG的發(fā)病機制有關(guān)。進一步檢測其血清中VEGF mRNA水平顯示，NVG患者血清中VEGF mRNA水平最高，其次是原發(fā)性青光眼患者，白內(nèi)障患者血清中VEGF mRNA水平最低；因此推測在正常生理狀態(tài)下，VEGF有助于維持血管的完整性，而在各種病理環(huán)境中，尤其是缺血、缺氧等環(huán)境下，VEGF水平會迅速增加，從而促進新生血管的生成。

在目前的臨床應(yīng)用和藥物研究中發(fā)現(xiàn)，抑制VEGF不能完全阻止新生血管化進程[15]，提示還可能存在其他促進血管生成的因子。WATANABE等[16]研究顯示，EPO可能具有促進血管新生的作用。隨著近年來研究的不斷深入，對EPO的認識也有了進一步提高，除了腎臟、肝臟，體內(nèi)其他組織也可以產(chǎn)生EPO[17-19]。目前較多學(xué)者認為VEGF是缺氧誘導(dǎo)血管新生的一個關(guān)鍵細胞因子，缺氧狀態(tài)下機體不僅會啟動HIF-1來上調(diào)VEGF基因的表達，還可以調(diào)節(jié)EPO基因的表達。FANDREY等[20]在癌細胞體外實驗培養(yǎng)基中加入過氧化氫后EPO生成減少。WATANABE等[16]研究發(fā)現(xiàn)，EPO具有促進新生血管形成的作用。以上研究均提示EPO有促進新生血管的作用，而其在NVG虹膜新生血管中的作用還未明確。

本研究結(jié)果顯示，NVG患者房水EPO水平高于原發(fā)性青光眼患者和白內(nèi)障患者，同時原發(fā)性青光眼患者房水EPO水平高于白內(nèi)障患者；而NVG患者、原發(fā)性青光眼患者、白內(nèi)障患者血清中EPO水平間無差異；與AURICCHIO等[21]、尚郡主等[22]研究結(jié)果相似。提示EPO局部水平的增加可能與青光眼發(fā)病后在高眼壓的情況下視乳頭血流灌注不足及組織缺血、缺氧有關(guān)。而檢測其血清中EPO mRNA水平顯示，NVG患者、原發(fā)性青光眼患者、白內(nèi)障患者血清中EPO mRNA水平無差異，原因有待進一步分析。

視網(wǎng)膜局部組織產(chǎn)生的EPO導(dǎo)致眼內(nèi)房水中EPO水平升高，該推斷在小鼠缺血引起的視網(wǎng)膜新生血管病變模型中得到了證明[23]。房水中EPO水平的增高很可能不是由于血-視網(wǎng)膜屏障的破壞，但目前還不能排除眼內(nèi)存在控制EPO表達機制的可能性。高眼壓狀態(tài)下眼內(nèi)局部組織缺血、缺氧，缺氧是激活HIF-1最重要的因素，在缺氧誘導(dǎo)下EPO是第一個被HIF-1識別的目標，血管生成的調(diào)節(jié)主要是由于缺氧誘導(dǎo)細胞過度表達HIF-1而引起的一系列改變。有研究表明HIF-1可以直接調(diào)控VEGF和EPO的表達[24]。在缺血缺氧條件下HIF-1容易被激活，分泌EPO增多，促進紅細胞分化成熟，同時VEGF水平被上調(diào)，促進局部組織新生血管的生成[25]。

近些年來，國內(nèi)、外對糖尿病視網(wǎng)膜病變中房水、玻璃體VEGF等相關(guān)因子的研究較多[26-28]，而對EPO等相關(guān)因子研究較少。WATANABE等[16]研究認為，VEGF、EPO是各自獨立的與增殖型糖尿病視網(wǎng)膜病變相關(guān)，且EPO與增殖型糖尿病視網(wǎng)膜病變的相關(guān)性大于VEGF。胡海晨[29]研究顯示增殖型糖尿病視網(wǎng)膜病變中VEGF、EPO間無交互影響。與以往研究有所不同，本研究觀察了NVG患者血清、房水中VEGF、EPO水平，并分析其相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清及房水中VEGF、EPO水平無相關(guān)性，但本研究只是初步探索，且樣本量較少，樣本的代表性較小，有待擴大樣本量進一步闡明VEGF、EPO與NVG發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

本研究選取年齡均衡的白內(nèi)障患者作為對照，TRIPATHI等[30]發(fā)現(xiàn)年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者眼內(nèi)房水的蛋白含量均在參考范圍，最能代表正常人的房水，避免其他因素對眼部的刺激，造成血-房水屏障破壞而導(dǎo)致眼內(nèi)各種因子含量的改變。

綜上所述，NVG患者房水中VEGF、EPO水平均較高，而血清及房水中VEGF、EPO水平無相關(guān)性，一定程度上說明VEGF、EPO在NVG的發(fā)病機制中可能是相互獨立的因素。但NVG的發(fā)生、發(fā)展是一個極其復(fù)雜的病理過程，參與其形成的細胞因子不止上述2個，相信隨著人們對NVG發(fā)病機制的進一步研究，將會發(fā)現(xiàn)和熟識更多相關(guān)因子，為NVG的早期診療提供新的思路及方法。同時提示臨床在控制NVG患者眼壓和改善眼部缺血時，還需注意眼內(nèi)免疫反應(yīng)及炎性反應(yīng)的變化。

作者貢獻：謝靜進行試驗設(shè)計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責(zé)；袁思奇、羅耀玲進行試驗實施、評估、資料收集；王輝進行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：毛亞敏)

Expression of Vascular Endothelial Growth Factor and Erythropoietin in Serum and Aqueous Humor of Neovascular Glaucoma Patients

XIEJing，WANGHui，YUANSi-qi，LUOYao-ling.DepartmentofOphthalmology,theFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalUniversity,Ganzhou341000,China

Correspondingauthor:XIEJing，DepartmentofOphthalmology,theFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalUniversity,Ganzhou341000,China；E-mail：xiejing503@163.com

Objective To explore the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF) and erythropoietin(EPO) in serum and aqueous humor of neovascular glaucoma(NVG) patients.Methods 20 patients with NVG(A group),20 patients with primary glaucoma (B group) and 20 patients with cataract (C group) were admitted in the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University in 2013.The VEGF and EPO in the serum and aqueous humor of 3 groups were measured using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method.The expression levels of serum VEGF and EPO mRNA of 3 groups were measured using RT-PCR method.Results There was no significant difference in serum EPO level among 3 groups (P>0.05).The serum VEGF level and aqueous humor levels of VEGF and EPO in B group and C group were lower than those in A group(P<0.05).The serum VEGF level and the aqueous humor levels of VEGF and EPO in C group were lower than those in B group(P<0.05).There was no linear correlation between serum and aqueous humor levels of VEGF and EPO of NVG patients (rvalues were-0.274 and -0.182,respectively,P>0.05).The expression levels of serum VEGF mRNA in B group and C group were lower than those in A group (P<0.05).The expression levels of serum VEGF mRNA in C group were lower than those in B group (P<0.05).There was no significant difference in expression level of serum EPO mRNA among 3 groups (P>0.05).Conclusion The levels of VEGF,EPO in aqueous humor of NVG patients are higher,and there is no linear correlation between levels of VEGF and EPO in serum and aqueous humor.It suggestes that VEGF and EPO might be independent factors in the pathogenesis of NVG to a certain extent.

Glaucoma,neovascular；Vascular endothelial growth factor A；Erythropoietin；Serum；Aqueous humor

江西省科技廳科技支撐基金資助項目(20122BBG70156-2)

341000江西省贛州市，贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院眼科

謝靜，341000江西省贛州市，贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院眼科；E-mail：xiejing503@163.com

R 775.9

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.33.010

2016-05-26；

2016-08-28)