葡萄糖糖基化大豆分離蛋白的凝膠抗凍性研究

杜昱蒙 陳振家 施小迪 徐婧婷 郭順堂

(中國農業大學食品學院 100083)

葡萄糖糖基化大豆分離蛋白的凝膠抗凍性研究

杜昱蒙 陳振家 施小迪 徐婧婷 郭順堂

(中國農業大學食品學院 100083)

為解決大豆蛋白在冷凍食品中因冷凍變性導致功能性下降的問題，本研究對大豆分離蛋白進行了葡萄糖糖基化改性，并分析了改性大豆分離蛋白凝膠的抗凍性變化。結果表明，葡萄糖改性可以提高大豆分離蛋白凝膠的抗凍性，糖基化改性反應條件為蛋白∶葡萄糖=2∶1、反應pH 7、蛋白含量為40 mg/g。糖基化改性蛋白制備的凝膠在凍藏過程中的蛋白溶解性、亞基及凝膠水分分布等結果顯示，改性大豆蛋白凝膠抗凍性的提高是由于糖基化蛋白中葡萄糖分子增強了對水分子的束縛作用從而減少蛋白質的脫水變性，同時，接枝在蛋白鏈上糖分子的空間位阻作用，阻止了蛋白分子間聚集和新鍵的形成，維持凝膠的均勻網狀結構。

糖基化 大豆分離蛋白 抗凍性

大豆分離蛋白(soybean protein isolate，SPI)具有很好的凝膠形成性，因而常被用作食品配料來提高產品的保水性和彈性等質構性質，改善產品的品質。然而，蛋白凝膠在冷凍條件下會發生冷凍變性，產生收縮、析水、硬度增加等現象，蛋白質的凝膠特性大大降低。導致蛋白冷凍變性的機理主要有三種學說[1]，一是結合水的脫離學說。蛋白在凍結過程中，尤其是緩慢凍結時，冰晶的形成會導致水分子的重新分布，解凍時游離的水分子不能返回到原來的位點(尤其是與蛋白質結合的水)而離開組織，即凍藏過程阻止了蛋白質的復水能力引起蛋白質的變性[2]。二是有關組織細胞中蛋白凍結變性學說，該學說認為凍結導致細胞液的離子濃度上升，pH發生變化而引起蛋白質的鹽析變性。當細胞中水分被凍結時，在凍結相中金屬鹽和有機物的濃度相對增大，相應的pH和離子強度也發生很大的變化，從而導致蛋白質的變性[3]。三是水和水合水的相互作用引起蛋白質變性的水化作用學說。該學說認為凍結時冰晶的形成會破壞結合水與蛋白質分子的結合狀態，導致蛋白質分子內部某些鍵的變化，包括舊鍵斷裂和新鍵(包括氫鍵、離子鍵、疏水作用和二硫鍵)的形成，這些變化都會改變蛋白質的內部結構，從而導致蛋白質的變性。因此，可通過向蛋白或組織中添加具有阻止水結晶或促進與蛋白質結合的物質作為抗凍劑才能夠改善蛋白質的抗凍性能。糖類是主要應用于海產品中的抗凍劑，工業上常用蔗糖和山梨醇混合物為抗凍劑。曲楠[4]等對羅非魚糜的研究發現，隨著凍藏時間的延長，添加10 %海藻糖對魚糜蛋白鹽溶性ATPase活性及巰基含量的下降趨勢有抑制作用，同時也阻止了魚糜的保水性、彈性和凝膠強度下降。

糖基化是制備功能性大豆分離蛋白常用的改性方法。大豆球蛋白(11S)與葡萄糖發生糖基化反應后，在一定時間內其產物溶解性隨時間增加逐漸變大。其主要原因可能是糖類含有多個親水羥基，糖基化的蛋白會由于引入羥基而使得其溶解性增加[5]。許彩虹[6]研究發現，葡聚糖以非共價鍵接入蛋白質肽鏈中，其空間位阻效應有利于提高蛋白熱致凝膠性質，以共價鍵結合的葡聚糖的空間位阻效應有利于保護蛋白質而使其不易發生熱變性而形成凝膠。但是，大豆蛋白經糖基化后是否能提高大豆蛋白的凝膠抗凍性卻鮮有報道。

為此，本研究以葡萄糖為原料對大豆分離蛋白進行糖基化改性，分析了大豆蛋白凝膠經冷凍、凍藏、解凍后凝膠特性的變化，提出了凝膠抗凍性評價方法，同時對糖基化條件進行了優化，以期為工業化進行抗凍型大豆分離蛋白的生產提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

低溫脫脂豆粕：安陽漫天雪食品制造公司，蛋白質(干基)> 50 %，大豆分離蛋白：實驗室自制，干基粗蛋白質量分數為85%，賴氨酸，十二烷基硫酸鈉，考馬斯亮藍G250：分析純，北京化學試劑公司，磷酸，乙醇，N,N’-甲叉雙丙烯酰胺：西格瑪奧德里奇貿易有限公司，三氯乙酸，葡萄糖，鄰苯二甲醛(OPA)：國藥化學試劑有限公司，牛血清白蛋白(BSA)：北京天來生物醫學科技有限公司，β-巰基乙醇(2-ME)：西格瑪奧德里奇貿易有限公司。

1.2 主要儀器及設備

LXJ-IIB低速離心機：上海安亭科學儀器廠；噴霧干燥塔：東京理化儀器株式會社；TSK-941L機械攪拌器：上海燦坤實業有限公司； CT 3質構儀：美國博勒飛儀器設備有限公司；電泳槽：日本BIO-CRAFT；Spectrum SP-2100UV紫外分光光度計：上海安亭儀器有限公司；358039型(10 mL)槌頭式組織研磨器：美國惠頓波特公司； NM120-Angiyst低場核磁共振分析成像儀：上海紐邁電子科技有限公司。

1.3 糖基化大豆分離蛋白的制備

按照豆粕與水的質量為1∶15的比例混合，于50 ℃、pH 8.0條件下攪拌1.5 h。然后將豆粕水溶液進行漿渣分離，4 000 r/min離心20 min，棄去沉淀，將上清液調pH 4.5靜置沉淀30 min，離心收集沉淀并加水復溶至指定pH值(pH 7, 8, 9)。將葡萄糖與大豆分離蛋白按一定比例(干基)混合成溶液(4∶1,2∶1, 4∶3, 1∶1, 1∶2)，邊攪拌邊加熱90～100 ℃，反應1.5 h；反應后迅速冷卻至室溫，終止反應，用HCl將溶液調至pH 4.5、靜置30 min，1 000 r/min離心5 min，收集蛋白沉淀。沉淀經復溶至蛋白含量分別為20、40、60 mg/g，用NaOH將溶液調至pH 7.0，剪切均質后噴霧干燥得到糖基化蛋白粉。噴霧干燥塔的噴霧干燥參數：進風口溫度為170～180 ℃，出風口溫度為70～80 ℃。

1.4 凝膠的制備

將自制的糖基化蛋白粉配成干物質質量分數為12%(m/m)的溶液，攪拌1.5 h，確保完全溶解，無結塊；攪拌后的溶液放入離心機中1 500 r/min離心5 min，去除氣泡，將溶液灌入直徑1 cm、長10 cm的注射器中，用保鮮膜封口；95 ℃水浴加熱處理1 h，放入10 ℃以下冰水中冷卻15 min，將樣品-18 ℃凍藏10 d后取樣品解凍5 h 再進行分析。未經過冷凍、凍藏、解凍處理的記為凍藏0 d。

1.5 自由氨基含量分析

參考了Brand C M J,2003[7]的方法。

試劑1∶40 mg OPA(鄰苯二甲醛)溶解于1 mL甲醇中(該試劑現用現配，并避光保存)；試劑2∶20%(m/m)的SDS 2.5 mL，0.1 mol/L的硼砂25 mL及100 μL β-巰基乙醇，最后用蒸餾水定容到50 mL，配成OPA試劑(棕色瓶避光保存)。測定時取200 μL樣品液和4 mL OPA試劑于試管中，充分震蕩，反應2 min后在340 nm下測其吸光值A340，以加入200 μL水代替樣品液為空白，以賴氨酸做出標準曲線，計算樣品中自由氨基的含量C。

式中：C0為糖基化反應前自由氨基含量/mmol/L；C1為糖基化反應后自由氨基含量/mmol/L。

1.6 凝膠持水性測定

將濾紙放入雙層離心管內管的底部，切取1.5 g左右的凝膠放入內管，記錄凝膠質量m及內管和凝膠總質量m1；4 000 r/min離心20 min，測內管及凝膠質量m2；

1.7 凝膠質構性質的測定

將凝膠切成直徑1 cm、高度1 cm的小塊，采用TPA質構分析，下壓距離：4 mm，觸發點負載：1.0 g，測試速度：0.50 mm/s，探頭為TA41。

1.8 可溶性蛋白含量測定

稱取1.5 g左右的凝膠，記錄質量M，將凝膠充分研磨，溶于80 mL蒸餾水中，磁力攪拌30 min。以牛血清白蛋白(BAS)為標樣，采用Bradford的方法測定可溶性蛋白質含量[8]。通過標準曲線查得樣品中蛋白的含量X(μg/mL)。用樣品中可溶蛋白與總蛋白的質量比(m/m)表示樣品的可溶蛋白含量。

1.9 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

方法參考Blakesley等[9]的方法。

1.10 凝膠凍藏前后水分分布情況

分別取凍藏前后的凝膠約2 g放入核磁管中，將核磁共振管放入低場核磁共振分析成像儀內，通過信號收集和反演，最后以弛豫時間(T2)為橫坐標，以弛豫時間對應的信號分量(Ai)為縱坐標作圖，由于樣品中水分的分布情況不同，因此在測試中表現的弛豫時間也不同。弛豫時間越小說明水分在凝膠中越不易流動。參數設置：磁場強度：0.5 T，共振頻率：21 ～23 MHz，線圈直徑：15 mm，磁場均勻度：2.5 × 10-6(12 mm×12 mm×12 mm)，磁體溫：32 ℃。

2 結果與分析

2.1 糖基化反應接枝度分析

糖基化反應也被稱為羰氨反應，即葡萄糖的羰基末端和蛋白質的氨基末端之間的反應，因此，通過測量糖基化反應前后自由氨基含量的變化，也就是接枝度，可以反映糖基化反應的程度。

如圖1a所示，不同底物比例(蛋白∶葡萄糖)對糖基化反應接枝度的影響，結果表明，隨著葡萄糖添加量的增加，接枝度不斷增加，蛋白∶糖=2∶1～1∶1時，接枝度變化不大，在13%左右；而蛋白∶糖=4∶1時，接枝度僅為5%左右；蛋白∶糖=1∶2時，接枝度達到21%。但糖基化反應pH對接枝度的影響不大，如圖1b。

反應底物濃度對接枝度有較大影響，如圖1c，當蛋白含量為20 mg/g時，反應底物濃度不足，糖基化接枝度較低；為60 mg/g時，由于蛋白濃度過高，在加熱過程中出現了絮凝，影響了糖基化反應的進行，因此，蛋白含量為40 mg/g的接枝效果最好。

2.2 糖基化反應條件對大豆蛋白凝膠特性的影響

糖基化反應中，葡萄糖的添加量不同對糖基化反應的程度和凝膠形成的影響見表1。大豆分離蛋白凝膠凍藏前持水性均在90 %左右，而經凍藏后為70 %，凝膠持水性均明顯下降。糖基化的蛋白凝膠經凍藏后持水性可以達到85 %以上。其中，蛋白∶葡萄糖=2∶1時，凝膠凍藏后的持水性降低較少。凝膠在凍藏過程中，水分不斷形成冰晶，從蛋白的持水結構中脫離，從而導致蛋白分子間發生聚集，形成分子質量更大的蛋白鏈，造成凝膠硬度增加，無論是否經過糖基化反應，凝膠凍藏后硬度都有明顯的上升，但經過糖基化改性處理的蛋白凝膠硬度較未改性的蛋白凝膠在凍藏后硬度增加較小。另外，葡萄糖添加比例并不對蛋白凝膠的硬度產生影響。

內聚性表示測試樣品經過第1次壓縮變形后所表現出來的對第2次壓縮的相對抵抗能力，可以用來描述凝膠的可恢復性和凝膠內部的組織強度[10]。表1顯示，凝膠凍藏后內聚性有所下降，說明凍藏過程中凝膠強度減弱，在經過第1次壓縮后恢復性變差。主要是因為在凍藏過程中蛋白變性、聚集，凝膠原有的均勻網狀結構被破壞。糖基化反應后，大豆分離蛋白內聚性與未經過處理的大豆分離蛋白間沒有明顯差異。說明糖基化反應并沒有對蛋白凝膠強度造成較大影響。

表1還顯示，糖基化改性的大豆蛋白凝膠經凍藏后，可溶性蛋白含量較未改性的大豆蛋白明顯上升，也就是說參與凝膠形成的蛋白含量減少，形成了弱凝膠。這是由于糖分子占據了蛋白間的結合位點，導致蛋白聚集程度下降；另一方面糖分子結合到蛋白上會產生一定的空間位阻，也在一定程度上減少了蛋白的聚集。而這種效果并不受糖添加量的影響，而蛋白的糖基化位點的結合程度是影響的蛋白凝膠凍結特性的主要因素。這種弱凝膠的形成會使糖基化后凝膠的硬度下降，但凝膠內聚性顯示糖基化反應并沒有對凝膠的強度產生太大的影響。

表2顯示了反應pH對凝膠凍藏前后特性的影響。反應pH對凝膠持水性和硬度影響不大；凍藏前，反應pH對凝膠的內聚性沒有影響，而凍藏后，pH 8處理的凝膠內聚性最大，說明適當的堿性條件會降低糖基化改性蛋白凍藏過程中凝膠強度的下降程度。反應pH對可溶蛋白的影響較大，隨著反應pH的升高，可溶性蛋白含量也有所上升，這可能和堿性條件下蛋白遠離等電點，蛋白與水的親和能力更強，減少了蛋白間的聚集有關。

注：反應pH: 7、蛋白質量分數：40 mg/g。

注：反應pH∶ 7、蛋白質量分數：40 mg/g。

注：底物比例：2∶1、反應pH∶7。圖1 不同反應條件對蛋白接枝度的影響

樣品(比例)持水性/%硬度/g內聚性可溶蛋白比例/%凍前凍后凍前凍后凍前凍后凍前凍后SPI90.44a±0.5073.93c±0.8023.13a±0.3432.7c±0.510.87ab±0.050.79de±0.0121.34a±0.8916.58e±1.004∶190.83a±0.8584.82de±0.366.87b±1.218.67d±0.830.83bc±0.020.77de±0.0336.66b±0.7628.95f±0.852∶190.78a±0.2387.65f±0.577.13b±0.319.60d±0.350.90a±0.040.82d±0.0334.46cd±0.8428.00f±1.304∶390.40a±0.4386.04e±1.147.33b±0.619.87d±0.310.86ab±0.030.81de±0.0536.90b±1.1427.83f±0.891∶190.77a±1.0484.29d±0.677.07b±0.2511.60d±0.870.84b±0.010.80de±0.0335.64bc±0.1322.59g±0.421∶290.77a±0.4385.76e±0.206.57b±0.218.40d±0.690.78c±0.040.75e±0.0433.60d±0.9726.16h±0.70

表2 反應pH對凝膠凍藏特性影響

表3 蛋白含量對凝膠凍藏特性影響

糖基化反應時的蛋白含量對凝膠凍藏后的持水性影響較大，蛋白含量過低會造成反應不充分，過高造成蛋白絮凝，而蛋白含量為40 mg/g時能獲得較好的凝膠持水性(表3)；同樣，蛋白含量對凝膠的硬度和內聚性影響比較大，這和接枝度的變化情況是一致的，其中蛋白含量40 mg/g時硬度最小，20 mg/g時其次，60 mg/g時最大；其中，蛋白含量40 mg/g，凝膠內聚性最大，而蛋白含量20 mg/g和60 mg/g時內聚性最小。凝膠凍藏前，糖基化反應時的蛋白含量的變化對凝膠中可溶蛋白含量的影響不大，而凍藏后，蛋白含量40 mg/g，凝膠中可溶性蛋白含量最大，而糖基化反應時蛋白含量過高或過低都會導致凝膠中可溶性蛋白含量處于較低水平。

通過綜合比較發現，糖基化反應中糖的添加量不宜過高，蛋白與糖的比例為2∶1時比較合適，反應pH對凝膠形成的影響不是很顯著，因此選擇pH為7，方便操作，而蛋白含量40 mg/g時凝膠有較好持水性和內聚性，表現出較好的抗凍特性。

2.3 蛋白凝膠SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結果分析

如圖2所示，糖基化后SPI的組成變化不大，但是，在泳道的上端，圖譜上出現了分子質量增大的擴散現象，尤其是在α’亞基上部有比較明顯的深色部分，說明葡萄糖糖基化反應后有某種分子質量較大的聚集體產生。這和蘇志光[11]的研究結果相似，也說明部分亞基與糖分子發生結合，分子質量有不同程度的增加。

注：從左數，泳道1～2(SPI)、泳道3～ 4(糖基化后SPI)分別為凍前和凍后的電泳圖譜。

圖2 不同反應條件對大豆分離蛋白亞基的影響

2.4 蛋白凝膠凍藏前后水分分布

如圖3所示，大豆分離蛋白(SPI)凝膠水分的弛豫時間主要分布在100 ms左右，且主要呈單一峰，主要表現為不易流動水[12]；而凍藏后，水分分布更加分散，并出現2個峰，一部分弛豫時間增大，說明凍藏后凝膠中的一部分水分變得更易流動，另一部分弛豫時間減小，由于和蛋白等物質作用更加緊密而表現出更不易流動的結合水的特征。而糖基化大豆蛋白凝膠(GLU)凍藏前水分的分布峰較未糖基化的大豆分離蛋白凝膠整體向弛豫時間長的方向略有遷移，說明糖基化大豆蛋白凝膠中易流動水較多，而凍藏后凝膠的水分分布情況幾乎沒有改變，說明蛋白通過糖基化反應，可以有效的維持凍藏過程中大豆分離蛋白在的持水性結構，提高了大豆蛋白的凝膠抗凍性。

圖3 大豆蛋白凝膠水分弛豫時間分布

3 討論與結論

潘錦鋒等[1]認為，糖類物質的抗凍作用機理是分子中的羥基與蛋白質分子的某些基團結合，使蛋白質分子的結合位點處于飽和狀態，從而避免蛋白質分子之間的聚集變性。同時，糖類物質的游離羥基還能有效地束縛水分子，從而降低“共晶點”溫度，減少冰晶體的形成量，形成一個不完全凍結區域，隔離和減緩蛋白質分子的聚集，進而防止蛋白質的凝聚變性。同時，糖基化蛋白分子上的羥基對水分子有一定的束縛能力，減少了蛋白質的脫水作用，一方面阻礙了蛋白分子間由于聚集所產生的新鍵的形成及構象的改變；另一方面提高了凝膠的持水性。因此，蛋白糖基化后增強了蛋白凝膠的抗凍能力。本研究中糖基化后的大豆分離蛋白制備的凝膠在凍藏后持水性還能維持在較高的水平，主要是保持了水分子在凝膠結構中的穩定性，從而使蛋白變性聚集的程度也得到了有效的控制，維持了蛋白凝膠的均勻網狀結構。

結果表明，糖基化改性可以提高大豆分離蛋白凝膠的抗凍性，糖基化改性反應條件為蛋白∶葡萄糖2∶1、反應pH 7、蛋白含量40 mg/g。糖基化改性后的大豆分離蛋白凝膠經冷凍、凍藏、解凍后持水性較未處理的樣品提高了13%，其持水性(87.65%)幾乎接近為冷凍前(90.78%)。同時由于引入親水基團，凝膠的可溶性蛋白含量明顯增加，致使參與凝膠形成的蛋白量減少，因此，造成了凝膠的硬度下降的問題。但也正是由于這種作用，有效阻止了凝膠凍藏過程中由于冰晶形成而造成的蛋白分子聚集，持水性變差的問題。并且，凝膠內聚性的數據結果顯示，糖基化改性并沒有造成凝膠內聚性的較大變化，也就是說糖基化改性在提高蛋白凝膠持水性的同時，并沒有影響凝膠內部鍵合作用強度。

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Antifreeze Capacity of Glucose Glycosylated Soybean Protein Isolate Gel

Du Yumeng Chen Zhenjia Shi Xiaodi Xu Jingting Guo Shuntang

(College of Food Sciences, China Agriculture University, Beijing 100083)

To solve the problem that the functional quality decreased caused by soy protein denaturation during frozen storage of frozen food, in this study, SPI (soybean protein isolate) was modified with glucose glycosylated modification, and the change of SPI gel antifreeze capacity was analyzed. According to the research results, the antifreeze capacity of SPI gel could be improved by glucose modification, and the glycosylated modified reaction condition was protein: glucose=2∶1, reaction pH=7, the content of protein was 40 mg/g. According to results such as protein solubility, subunits and gel water distribution of gel produced by glycosylated modified protein during frozen storage, it was concluded that the reason why the antifreeze capacity of modified soybean protein gel was improved was that glucose molecule in the glycosylated modified strengthened constraint of water molecules to reduce the dewatering denaturation of protein. Meanwhile, the steric hindrance effect of sugar molecule grafted on the protein chain could stop aggregation among protein molecules and formation of new bond to keep uniform reticular formation of gel.

glycosylation, SPI (soy protein isolate), antifreeze

TS214.2

A

1003-0174(2016)10-0045-06

國家科技支撐計劃(2012BAD34B04)

2015-03-06

杜昱蒙，女，1992年出生，碩士，植物蛋白加工與利用

郭順堂，男，1962年出生，教授，植物蛋白加工與利用