膈下逐瘀沖劑對沙眼衣原體輸卵管炎性不孕小鼠細胞因子影響的研究*

劉 麗 李 楊 李世大

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【實驗研究】

膈下逐瘀沖劑對沙眼衣原體輸卵管炎性不孕小鼠細胞因子影響的研究*

劉 麗1李 楊2李世大3

目的探討膈下逐瘀沖劑對沙眼衣原體輸卵管炎性不孕小鼠細胞因子表達的影響，闡明藥物的作用機理和具體療效。方法選取6～8周雌性C3H/HeN小鼠100只，隨機分為空白對照組、模型組、阿奇霉素組、膈下逐瘀沖劑組、膈下+阿奇組5組，每組20只。采用“沙眼衣原體陰道接種法”復制輸卵管炎性不孕模型，接種第8周不同組按組給予藥物灌胃15天。處死后免疫組化法檢測TNF-a、IL-6、IL-8。結果與空白對照組比較，模型組IL-6、IL-8 及TNF-α陽性表達均升高，差異具有統計學意義(P< 0.05)。與模型組比較，阿奇霉素組和膈下逐瘀沖劑組、膈下+阿奇組IL-6、IL-8 及TNF-α陽性表達下降，差異有統計學意義(P<0.05)；膈下逐瘀沖劑組、膈下+阿奇組IL-6、IL-8 及TNF-α陽性表達明顯低于阿奇霉素組，具有統計學意義(P<0.05)。結論膈下逐瘀沖劑具有抗炎和提高免疫的作用，阿奇霉素與膈下逐沖劑合用可以有效治療沙眼衣原體感染所致輸卵管炎。

膈下逐瘀沖劑；輸卵管炎性不孕；細胞因子；沙眼衣原體

隨著社會的發展，不孕不育癥的發病率不斷上升，逐漸成為一個世界性難題。據我國性病統計資料顯示，由沙眼衣原體(CT)引起的非淋菌性尿道炎(宮頸炎)、輸卵管炎的發病率，在近兩年來以23%～75%的速度遞增[1]。據美國CDC統計，美國每年有400萬生殖道沙眼衣原體感染新發病例[2]。國內外研究均已證實，CT是影響人類生殖健康的重要病原體之一。輸卵管炎感染初期多無明顯表現，慢性期會有一側或雙側下腹部隱痛，白帶異常等表現，常被人忽視。目前西醫主要采用抗生素的治療，效果尚可，但復發率較高，治療費用相對較高，且已有不少菌株產生耐藥，而中醫藥的應用占有一定的優勢，且發展前景較大。目前尋求一種有效的方法治療本病是婦科學研究焦點。本病病機多數醫家認為與瘀血關系較為密切，《醫宗金鑒》云 ：“或因宿血積于胞中， 新血不能成孕……壅塞胞中而不孕。”許潤三教授認為輸卵管炎積水性不孕形成的主要機制是“血瘀水停，阻于胞脈”[3]。劉麗教授秉承歷代醫家不孕癥治療理念，結合多年治療輸卵管炎性不孕癥經驗總結出“活血化瘀、行氣止痛”治療大法，并結合此法對王清任的膈下逐瘀湯加減化裁出我院內制劑“膈下逐瘀沖劑”。本實驗致力于探討其治療輸卵管炎性不孕的作用機制，為臨床治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌種與試劑沙眼衣原體(由復旦大學附屬公共衛生臨床中心周曉輝教授饋贈)：保存于本實驗室-70℃超低溫冰箱。TNF-α、IL-6、IL-8免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.2 實驗動物清潔級6～8周雌性C3H/HeN小鼠，體質量(20±2)g，購買于中山大學動物實驗中心，飼養在黑龍江中醫藥大學婦科實驗室清潔動物房，溫度18℃～24℃，光暗周期12h。

1.1.3 實驗藥物膈下逐瘀沖劑由黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院天江藥局提供，藥物組成為牡丹皮2 袋，鱉甲1 袋，烏藥1 袋，川芎2 袋，香附2 袋，枳殼1 袋，延胡索2 袋，桃仁1 袋，赤芍2 袋，地龍1 袋； 阿奇霉素分散片(哈藥集團三精制藥諾捷有限責任公司，批準文號：H20057906)。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株培養沙眼衣原體小鼠生物型菌株和McCOy細胞，本實驗室保存傳代，用RPMI1640生長培養基，蔗糖谷氨基酸鉀稀釋液(SPG)液中保存。沙眼衣原體小鼠生物型菌株體外培養，制備感染液，用沙眼衣原體小鼠生物型菌株感染McCOy細胞在含有10%胎牛血清的1640培養液中培養，收集單層感染McCOy細胞，超聲碎解細胞30s，在4℃下500r /min離心10min，吸取上層液，在4℃下30000r/min，離心45min，取沉淀，用SPG-70℃保存。

1.2.2 膈下逐瘀沖劑、阿奇霉素的制備膈下逐瘀沖劑：由黑龍江中醫藥大學制劑室提供(產品批號：20100226)每袋6g(相當于生藥20g)，日3次口服，根據小鼠與人體表面積轉換系數計算(每人每天60 g)，將膈下逐瘀制為：60 g×0.0026=0.156g，0.156g/0.4ml=0.39 g/ml；阿奇霉素片(產品批號：101012)以蒸餾水溶化，調成溶液濃度為6.5g/ml。 每鼠0.4ml/天灌胃。

1.2.3 造模方法雌性C3H/HeN小鼠100只，隨機分為空白對照組、模型組、阿奇霉素組、膈下逐瘀沖劑組、膈下+阿奇組5組，每組20只。除空白對照組外其余4組雌性小鼠先后用1.5%的戊巴比妥鈉(60mg/kg)腹腔注射麻醉后，用0.1%新潔爾滅消毒外陰，再用0.9%的生理鹽水清洗；分別用濃度為含106IFU 的感染液50UL，用無菌500UL微量注射器(針頭套硅膠硬外麻套管)通過陰道內接種感染。空白對照組用無沙眼衣原體感染的McCOy細胞感染液(SPG)陰道接種，術后禁食不禁水，待小鼠正常排便后常規飼養。

1.2.4 給藥方法陰道接種7周后每日上午8 時灌胃1次，每次0.4ml，連續灌胃15天，模型組、空白對照組給同等量的生理鹽水灌胃治療15天。

1.2.5 標本采集方法灌胃15天后，清晨予以禁食、不禁水，采用頸椎脫臼法處死小鼠，開腹找到輸卵管，快速剝離性腺旁脂肪、卵巢、子宮，取標本，放入4%多聚甲醛溶液中固定，待用。

1.2.6 指標檢測免疫組化法檢測TNF-α、IL-6、IL-8蛋白的表達。

1.2.7 免疫組化陽性判斷標準采用半定量分析法[4]：判定標準為細胞質中出現棕黃色顆粒，將其染色強度分四級：陰性(-)：細胞無任何著色或出現陽性細胞數比例<5%；弱陽性(+)：細胞輕度著色，呈淡黃色，陽性細胞數占5%～25%；陽性(++)：細胞著色呈深黃色，陽性細胞數占25%～50%；強陽性(+++)：細胞明顯著色，呈深棕色，陽性細胞數占>50%。

2 結果

2.1 光鏡下輸卵管組織病理改變造模后，輸卵管組織經HE染色，光鏡下可見管壁結構無明顯分界，見結締組織增生，黏膜柱狀上皮細胞成矮柱狀，頂部纖毛變短，部分脫落，管腔內纖毛排列不整齊，部分管腔堵塞，漿膜層可見淋巴細胞、漿細胞及少量嗜酸性粒細胞等浸潤。

2.2 對大鼠輸卵管組織IL-6陽性表達的影響與正常組比較，模型組IL-6陽性表達均升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，阿奇霉素組和膈下逐瘀沖劑組、膈下+阿奇組IL-6陽性表達下降，差異有統計學意義(P<0.05)；膈下逐瘀沖劑組、膈下+阿奇組IL-6陽性表達明顯低于阿奇霉素組，具有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 對大鼠輸卵管組織IL-6陽性表達的影響

2.3 對大鼠輸卵管組織IL-8 陽性表達的影響與正常組比較，模型組IL-8陽性表達均升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，阿奇霉素組和膈下逐瘀沖劑組、膈下+阿奇組IL-8陽性表達下降，差異有統計學意義(P<0.05)；膈下逐瘀沖劑組、膈下+阿奇組IL-8陽性表達明顯低于阿奇霉素組，具有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 對大鼠輸卵管組織IL-8 陽性表達的影響

2.4 對大鼠輸卵管組織TNF-α陽性表達的影響與正常組比較，模型組TNF-α陽性表達均升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，阿奇霉素組和膈下逐瘀沖劑組、膈下+阿奇組TNF-α陽性表達下降，差異有統計學意義(P<0.05)；膈下逐瘀沖劑組、膈下+阿奇組TNF-α陽性表達明顯低于阿奇霉素組，具有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 對大鼠輸卵管組織TNF-α陽性表達的影響

3 討論

輸卵管炎性不孕癥，檢索中醫古典著作，未查閱到明確敘述，但根據其少腹部疼痛、痛經、少腹部觸及包塊等臨床特點，可散見于“腹痛”“癥瘕”“痛經”“熱入血室”“不孕癥”等病證中。在臨床治療輸卵管炎性不孕癥中運用膈下逐瘀沖劑得到了較好療效。膈下逐瘀湯為王清任《醫林改錯》中代表方劑，用于治療瘀血阻滯膈下證，劉麗教授根據多年治療輸卵管炎性不孕癥經驗，加減化裁方由川芎、赤芍、牡丹皮、桃仁、香附、延胡索、烏藥、枳殼、鱉甲、地龍組成。桃仁活血祛瘀，潤腸通便，止咳平喘。《本草綱目》云：“主瘀血，血閉癥瘕，邪氣……”牡丹皮清熱涼血、活血散瘀。《滇南本草》：“破血，行(血)，消癥瘕之疾，除血分之熱”。赤芍瀉肝清熱，散瘀活血止痛。《滇南本草》曰：“瀉脾火，降氣，行血，破瘀，散血塊，止腹痛，攻癰瘡。”烏藥行氣止痛，溫腎散寒。《本草拾遺》：“主中惡心腹痛……婦人血氣，小兒腹中諸蟲。”延胡索活血行氣止痛。《本草綱目》：“延胡索，能行血中氣滯，故專治一身上下諸痛。”川芎活血行氣，祛風止痛。《神農本草經》：“主中風入腦頭痛，寒痹，筋攣緩急，金瘡，婦人血閉無子。”香附疏肝理氣，調經止痛。《本草綱目》：“利三焦，解六郁，消飲食積聚，痰飲痞滿，胕腫腹脹，腳氣，止心腹、肢體、頭目、齒耳諸痛……婦人崩漏帶下、月經不調，胎前產后百病。”枳殼破氣除痞，化痰消積。《日華子》：“破瘕結痃癖，五膈氣”。地龍清熱、平肝、止喘、通絡。《本草綱目》：“性寒而下行，性寒故能解諸熱疾”鱉甲滋陰潛陽，軟堅散結。用于癥瘕積聚之證。《神農本草經》：“主心腹癥瘕堅積，寒熱，去痞息肉，陰蝕，痔，惡肉。”諸藥合用共奏活血化瘀，行氣止痛之功，又因“氣行則血行”故活血藥必配以行氣藥，使瘀滯得除。

細胞因子具有介導和調控免疫、炎癥過程的功能，對機體感染、炎癥、創傷及免疫應答有調節作用[5]。IL-6、IL-8、TNF-α屬于促炎細胞因子。當機體感染CT時刺激單核細胞、巨噬細胞和內皮細胞分泌IL-6、IL-8、TNF-α、繼而活化T細胞，產生TNF-α，TNF-α在正常輸卵管和炎性輸卵管上皮細胞均有表達，它可誘導機體產生一些有害物質，激活單核細胞，巨噬細胞，TNF-α可誘導機體產生一些有害物質，激活單核細胞，巨噬細胞，誘導IL-6、IL-8合成，促進炎癥反應[6]。簡言之，三者產生越多，輸卵管損傷越重。本實驗應用膈下逐瘀沖劑干預沙眼衣原體致輸卵管炎性不孕癥大鼠，膈下逐瘀沖劑組，阿奇霉素組和阿奇+膈下逐瘀沖劑組均能降低IL-6、IL-8和TNF-α表達，且阿奇+膈下逐瘀沖劑組能明顯抑制三者表達。三組結果對比說明膈下逐瘀沖劑具有抗炎作用且抗炎效果優于阿奇霉素，二者合用可使炎性輸卵管細胞中IL-6、IL-8和TNF-α表達接近或恢復正常，可能為其治療輸卵管炎性不孕的作用機制，發揮其抗炎作用，從而控制炎癥發展。

綜上所述，膈下逐瘀沖劑具有抗炎和提高免疫的作用，阿奇霉素與膈下逐瘀沖劑合用可以有效治療沙眼衣原體感染所致輸卵管炎。

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黑龍江省教育廳科學技術研究項目(No.12521504)

1.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院婦科二科(哈爾濱 150036)；2.黑龍江中醫藥大學中醫婦科學碩士研究生2014級(黑龍江 150036)；3.黑龍江省中醫藥科學院男科(黑龍江 150036)

10.3969/j.issn.1003-8914.2016.22.018

1003-8914(2016)-22-3268-03

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2016-08-09)