液下單液滴微萃取/快速氣相色譜-質譜聯用法測定蔬菜中多種有機磷農藥殘留

胡美華，朱惠芳，馬麗芳

(南昌市疾病預防控制中心,江西 南昌 330038)

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液下單液滴微萃取/快速氣相色譜-質譜聯用法測定蔬菜中多種有機磷農藥殘留

胡美華*，朱惠芳，馬麗芳

(南昌市疾病預防控制中心,江西 南昌 330038)

建立了液下單液滴微萃取/快速氣相色譜-質譜聯用測定蔬菜中多種有機磷農藥殘留的方法，并對前處理條件進行了優化。采用液下單液滴微萃取技術對樣品進行萃取和濃縮，以快速氣相色譜-質譜(GC-MS)分離檢測，內標法定量。在優化條件下，治螟磷、甲拌磷、異稻瘟凈、甲基對硫磷、皮蠅磷、馬拉硫磷、毒死蜱、水胺硫磷和喹硫磷9種有機磷農藥的色譜峰分離良好，相關系數均不低于0.995 8，檢出限為0.32～0.91 μg/kg，加標回收率為83.2%～134.5%，相對標準偏差(n=5)為3.4%～16.5%。該方法樣品前處理簡單，分析快速，靈敏度高，能夠應用于蔬菜中這9種有機磷農藥殘留的檢測。

液下單液滴微萃取；有機磷；快速；氣相色譜-質譜聯用；蔬菜

眾所周知，農藥在防治病蟲害、去除雜草、提高農業經濟效益以及控制人畜傳染病等方面起關鍵作用。為此，從20世紀40年代開始，農藥已成為提高農產品產量和質量的不可或缺的中堅力量。據估計，若不對農作物使用農藥，全世界每年因病、蟲、草害約損失糧食總產量的50%，而使用農藥可挽回上述損失中的30%，農藥的效益大約是其使用成本的4倍[1]。但農藥在給人們帶來好處的同時，也給人們帶來了危害。如有機磷被人體吸收后，與乙酰膽堿酯酶結合，將破壞神經功能，易導致人體麻痹甚至死亡[2]。據調查，我國蔬菜、水果和糧食的農藥超標率平均為22.15%，18.79%和6.2%[3]。隨著有機磷農藥在農業中的廣泛應用，大量的農藥殘留出現在食品、土壤和水中。因而，研究有機磷農藥殘留檢測技術具有重要意義。

氣相色譜法具有分離效率高、靈敏、快速等優點，是有機磷農藥殘留分析最常用的檢測方法[4-5]。近年來，隨著科技的發展，各種聯用和快速分析技術朝著省時省力、環境友好、快速、低成本等方向發展，已成為當今研究的熱點[6]。在有機磷農藥殘留分析中，樣品前處理技術直接影響檢測分析的成分、效率，并在很大程度上決定了分析結果的可靠性。在有機磷農藥分析中，常見的樣品前處理技術有液-液萃取[7]、固相萃取[8]和固相微萃取[9]等。但這些前處理技術具有有機試劑使用多、耗時、成本高等不足。

單液滴微萃取技術是由Jeannot和Cantwell[10]在1996年提出的一種新型前處理技術。該技術通過將吸取一定體積萃取劑的微量進樣針插入待測試樣的頂空或溶液中，然后緩慢推出萃取劑，使其懸掛于進樣針針尖的頂端，萃取一定時間后，將液滴吸回至進樣針。與傳統的液-液萃取法相比，單液滴微萃取法具有簡單、快速、靈敏、廉價、環境友好，以及集采樣、萃取和濃縮于一體等優點。本課題組已將該技術結合氣相色譜法成功應用于奶粉和尿液中碘的測定[11]。

隨著科技的發展，快速分析已成為當前研究熱點。快速氣相色譜能夠解決多種化合物分析時間長的缺點[6,12-13]，分析檢測滿足更高效、更靈敏的需求。本文采用液下單液滴微萃取技術萃取和富集蔬菜中的有機磷農藥，結合快速氣相色譜-質譜法同時測定了治螟磷、甲拌磷、異稻瘟凈、甲基對硫磷、皮蠅磷、馬拉硫磷、毒死蜱、水胺硫磷、喹硫磷9種有機磷農藥殘留。該方法較國標法分析時間大大縮短，靈敏度有較大提高，可實現有機磷農藥痕量殘留的快速同時測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

日本島津GCMS-QP2010氣質聯用儀；日本島津GCMS-Solution工作站；美國Restek RTX-5(10 m×0.1 mm×0.1 μm)石英毛細管色譜柱，美國DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)石英毛細管色譜柱；20 mL頂空瓶；美國Hamilton 10 μL微量進樣針；德國IKA磁力攪拌器；美國Alltech Milli-Q純水機。

農藥標準品(治螟磷、甲拌磷、異稻瘟凈、甲基對硫磷、皮蠅磷、馬拉硫磷、毒死蜱、水胺硫磷、喹硫磷)濃度均為100 μg/mL，均購自農業部環境保護科研監測所；D10-毒死蜱(Dr.Ehrenstorfer公司，純度為97.0 %)；乙腈(色譜純，美國Tedia公司)，甲苯、氯仿、四氯化碳、十六烷、正辛醇(優質純，國藥集團化學試劑有限公司)；鹽酸、氯化鈉(分析純，上海化學試劑公司)；實驗用水為超純水，電阻率為18.2 MΩ·cm(25 ℃)。

1.2 實驗方法

1.2.1 儀器條件 色譜條件A：DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)石英毛細管色譜柱；柱前壓140.4 kPa；柱溫采用程序升溫：初始溫度82 ℃，保持5 min，再以9 ℃/min升至280 ℃，保持15 min。初始狀態為不分流進樣，1 min后打開分流閥，分流比30∶1；溶劑延遲9.0 min，9.1 min后采集信號。

色譜條件B：Rtx-5(10 m×0.1 mm×0.1 μm) 石英毛細管色譜柱；柱前壓409.6 kPa；柱溫采用程序升溫：初始溫度82 ℃，保持1.3 min，以35 ℃/min至280 ℃，保持4 min。初始狀態為不分流進樣，1 min后打開分流閥，分流比30∶1；溶劑延遲2.5 min，2.6 min后采集信號。

進樣口溫度均為180 ℃；離子源溫度220 ℃；接口溫度280 ℃；載氣為He(99.999%)。

質譜條件：電子轟擊離子源(EI)，電子能量70 eV，電子倍增器電壓1.0 kV，采用選擇離子方式(SIM)檢測。各分析物的監測離子見表1。

1.2.2 標準儲備液 分別準確吸取各有機磷農藥標準品0.5 mL于10 mL容量瓶中，以乙腈定容至刻度，得各標準儲備液濃度為5 μg/mL；內標物儲備液：稱取D10-毒死蜱5.0 mg于100 mL 容量瓶中，以乙腈定容至刻度，得內標物的濃度為50 μg/mL。

1.2.3 樣品前處理 蔬菜洗凈后，取可食部分，稱取20.0 g樣品，加入40 mL乙腈勻漿，加5 g氯化鈉，勻漿1 min，得到提取液，于3 000 r/min離心5 min，取0.75 mL上清液于含攪拌子的頂空瓶中，同時加濃度為50 μg/mL的內標D10-毒死蜱40 μL，用超純水定容至10 mL，壓蓋，置于磁力攪拌器上。

微量進樣針吸取一定量的萃取劑，插入頂空瓶液面以下，將萃取劑慢慢推出，懸于針尖，開啟攪拌器，萃取一定時間后，將萃取劑吸回微量進樣針，進GC-MS聯用儀分析。

2 結果與討論

2.1 色譜柱的選擇

快速氣相色譜的分離速度和分辨率通常受色譜柱的長度、內徑、膜厚、填料顆粒大小以及載氣、柱前壓和程序升溫等因素影響[13]。本實驗采用傳統的DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)石英毛細管色譜柱(色譜條件A)和Rtx-5(10 m×0.1 mm×0.1 μm) 石英毛細管色譜柱(色譜條件B)對9種農藥混合標準以直接進行方式進行分離分析。在色譜條件A下分析得到的譜圖見圖1A，采用GC Method translation[14]軟件將色譜條件A轉換成色譜條件B進行分析得到的譜圖見圖1B。由圖可見，在這兩種色譜條件下，各有機磷農藥分離良好，但分析時間由色譜條件A的25 min縮短至色譜條件B的6 min，顯著節約了分析時間。因此，本文采用快速色譜條件，即色譜條件B進行樣品檢測，不需對色譜條件重新摸索[15]。

圖1 有機磷混標(1.0 μg/mL)的GC-MS選擇離子圖

Fig.1 GC-MS(SIM) chromatograms of organophosphorous pesticides standards at 1.0 μg/mL

A：conventional narrow bore column,B：micro diameter column；1.sulfotep,2.phorate,3.iprobenfos,4.methyl parathion,5.ronnel,6.malathion,7.D10-chlorpyrifos,8.chlorpyrifos,9.isocarbophos,10.quinalphos

2.2 微萃取條件的優化

2.2.1 萃取溶劑的選擇 合適的萃取劑在單液滴微萃取中起著重要作用。萃取劑的選擇應符合化學穩定性好、與水不互溶、蒸汽壓低以及黏度大等要求。考察了甲苯、四氯化碳、氯仿、十六烷和正辛醇對9種有機磷農藥的萃取效率。結果顯示，十六烷和正辛醇幾乎不能提取這9種農藥，甲苯、四氯化碳和氯仿對這些有機磷農藥有一定的提取效率，但在相同條件下，氯仿的提取效率最高。因此，本實驗選擇氯仿作為萃取劑。

2.2.2 單液滴體積的選擇 液滴體積的大小對目標物的萃取效率影響很大。一般來說，體積越大，萃取效率越高。實驗考察了0.5，1.0，2.0 μL的氯仿對9種有機磷農藥的萃取效率。結果表明，萃取體積由0.5 μL增至1.0 μL時，萃取效率明顯提高。然而，當液滴體積為2.0 μL時，液滴不穩定，且由于本文采用微口徑的毛細管柱，液滴體積的增大可能會使色譜柱容量達到飽和。故本實驗選用1.0 μL為最佳液滴體積。

2.2.3 萃取時間的選擇 單液滴微萃取過程是有機相與水相的動態平衡過程，萃取時間的長短直接影響萃取效率[16]。比較了攪拌時間分別為5，10，15，20 min時對萃取效率的影響。結果表明，隨著萃取時間由5 min增至15 min，各有機磷農藥的萃取效率明顯提高，但繼續增至20 min時，治螟磷、馬拉硫磷和喹硫磷的萃取基本達到平衡；甲拌磷和甲基對硫磷的萃取效率有所下降；其它有機磷農藥的萃取效率則提高。這可能是隨著提取時間的延長，各有機磷之間存在著不同競爭吸附作用所致。此外，延長萃取時間，會使液滴中產生大的氣泡，影響其穩定性。因此本實驗最終選取15 min作為最佳萃取時間。

2.2.4 攪拌速率的選擇 攪拌速率是影響兩相平衡的重要因素[17]。攪拌速率過快可使得平衡時間縮短，但同時液滴的穩定性減小。考察了攪拌速率為0，150，200，250，300 r/min時的影響。結果顯示，各有機磷農藥的萃取效率隨著攪拌速率的增大而增加，當攪拌速率增大到300 r/min時，甲拌磷、甲基對硫磷和馬拉硫磷的萃取效率有所下降，毒死蜱的萃取效率增加，其它農藥幾乎不變。但液滴不穩定，重現性差。因此，選擇250 r/min為最佳攪拌速率。

2.2.5 鹽效應的影響 鹽的加入能減少目標物在水中的溶解性，從而有利于目標物的萃取。考察了0%，10%，20%，30%和36%(飽和)氯化鈉對萃取效率的影響。由實驗結果可知，隨著鹽用量的加大，萃取效率無明顯變化，但氣泡更易從水相析出，使液滴不穩定，從而引起分析結果的不可靠性。故實驗最終選擇不加氯化鈉。

2.2.6 乙腈比例的選擇 按照GB/T 19648-2006[18]對樣品采用乙腈提取，吸取一定量的提取液于20 mL頂空瓶中，用水稀釋至10 mL。因此，乙腈的量對有機磷的溶出效果可能有一定影響，從而影響萃取效果。考察了乙腈比例為2.5%，5.0%和7.5%時的萃取效果。結果顯示，乙腈比例越大，萃取效果越好，同時液滴的穩定性也越差。綜合考慮，本實驗選擇7.5%的乙腈比例進行實驗。

2.3 方法的線性及檢出限

分別取300，150，37.5，15.0，7.5，3.8 μL標準儲備液，及分別移取40 μL內標物儲備液于100 mL容量瓶中，用水定容，得濃度分別為15.0，7.5，1.9，0.75，0.38，0.19 ng/mL的系列各標準溶液，內標濃度為20 ng/mL。在優化條件下,以待測物峰面積與內標峰面積比(Y)為縱坐標，對應化合物質量濃度(X，ng/mL)為橫坐標進行線性回歸分析；以3倍信噪比計算檢出限(LOD)，結果見表1。由表1可見，在一定濃度范圍內，各農藥均有較好的線性相關性，相關系數(r)均不低于0.995 8，檢出限為0.32～0.91 μg/kg。

表1 9種農藥的線性范圍、線性方程、相關系數(r)及檢出限

Table 1 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients and limits of detection of 9 pesticides

Compoundm/zLinearranges(ng/mL)LinearequationrLOD(μg/kg)Sulfotep(治螟磷)322?202，238019～150Y=00014X+0003709993035Phorate(甲拌磷)260?121，231019～150Y=00061X+0000409989053Iprobenfos(異稻瘟凈)204?246，288038～150Y=00036X+0000909964072Methylparathion(甲基對硫磷)263?233，246019～150Y=00087X+0003609970032Ronnel(皮蠅磷)285?287，125019～150Y=00150X+0000809993037Malathion(馬拉硫磷)173?158，143038～150Y=00018X+0001509958091Chlorpyrifos(毒死蜱)314?258，286019～150Y=00034X+0002409993051Isocarbophos(水胺硫磷)136?230，289038～150Y=00033X+0001609975085Quinalphos(喹硫磷)146?298，157019～150Y=00099X+0002609965072

Y:ratio of standard peak area and internal standard peak area;X:concentration of pesticide;*：quantitative ion

2.4 實際樣品的檢測及回收率實驗

圖2 加標樣品(加標濃度130 ng/g)的GC-MS選擇離子圖Fig.2 GC-MS(SIM) chromatogram of a spiked sample(spiked 130 ng/g) peak number(1-10) was the same as that in Fig.1

將隨機購于南昌各超市和農貿市場的蔬菜樣品洗凈后，取可食部分，采用“1.2.3”方法進行樣品前處理，在優化條件下對樣品進樣分析，同時進行加標回收率實驗，每個樣品進行5次平行實驗，結果見表2。由表2可知，各農藥的加標回收率為83.2%～134.5%，相對標準偏差為3.4%～16.5%。圖2為一蔬菜加標樣品(加標濃度為130 ng/g)的GC-MS選擇離子圖。

表2 實際樣品的測定及加標回收率

Table 2 The determination of real samples and its spiked recoveries

PesticideFound(mg/kg)?Spiked(mg/kg)Recovery/%RSD/%CabbageCucumberCabbageCucumberSulfotep-，-0013，013908，951931，95754，79103，89Phorate-，-0013，013853，9251105，106449，4469，76Iprobenfos-，-0013，013926，918936，899115，8883，83Methylparathion-，-0013，0131124，1021907，94858，8797，62Ronnel-，-0013，013895，967969，104267，34102，56Malathion-，-0013，013957，863884，97194，7543，51Chlorpyrifos-，0000680013，013923，906975，93740，35115，80Isocarbophos-，-0013，013921，8841345，1128100，85129，137Quinalphos-，-0013，013832，8651252，849143，125151，165

*no detected

3 結 論

通過GC方法轉換軟件，將常規色譜條件轉換為快速色譜條件，結合單液滴微萃取前處理技術，建立了同時測定蔬菜中多種有機磷農藥殘留的快速氣相色譜-質譜聯用法。并對單液滴微萃取技術中萃取劑的選擇及用量、乙腈的體積、萃取時間、攪拌速率和鹽效應等進行了優化。采用本方法測定治螟磷9種有機磷農藥的保留時間僅需6 min，與國標法相比，分析時間縮短，且大大提高了方法靈敏度。應用此法能夠實現蔬菜中治螟磷、甲拌磷、異稻瘟凈、甲基對硫磷、皮蠅磷、馬拉硫磷、毒死蜱、水胺硫磷和喹硫磷的同時快速測定。

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Determination of Organophosphorus Pesticides Residues in Vegetables by Rapid GC-MS Coupled with Direct Single-drop Microextraction

HU Mei-hua*,ZHU Hui-fang,MA Li-fang

(Nanchang Center for Disease Control and Prevention,Nanchang 330038,China)

A rapid method was developed for the determination of organophosphorus pesticides residues in vegetables using GC-MS coupled with direct single-drop microextraction(SDME).The samples were extracted and enriched by direct SDME,then the target compounds were analyzed by GC-MS under selected-ion monitering(SIM) mode,and quantified by the internal standard.Under the optimized conditions,9 kinds of organophosphorus pesticides,including sulfotep,phorate,iprobenfos,methyl parathion,ronnel,malathion,chlorpyrifos,isocarbophos and quinalphos,were successfully separated.The correlation coefficients were not less than 0.995 8,and the detection limits ranged from 0.32 μg/kg to 0.91 μg/kg.The recoveries were in the range of 83.2%-134.5% with RSDs(n=5) of 3.4%-16.5%.The developed method was simple,rapid and sensitive,and could be applied in the determination of 9 kinds of organophosphorus pesticides residues in vegetables.Key words：direct single-drop microextraction;organophosphorus;rapid;gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS);vegetables

2015-10-07；

2015-11-13

南昌市科技局項目(洪財企[2012]80號 社發-7-1)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.05.012

O657.63；F767.2

A

1004-4957(2016)05-0569-05

*通訊作者：胡美華，碩士，主管技師，研究方向：理化檢驗，Tel:0791-86363387,E-mail:cycle110@163.com