一種新型PDE-5抑制劑衍生物的發(fā)現(xiàn)及結構鑒定

馬春艷，段 瓊，封淑華

(河北省藥品檢驗研究院,河北 石家莊 050011)

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一種新型PDE-5抑制劑衍生物的發(fā)現(xiàn)及結構鑒定

馬春艷，段 瓊，封淑華*

(河北省藥品檢驗研究院,河北 石家莊 050011)

基于超高效液相色譜電噴霧四極桿飛行時間串聯(lián)質譜聯(lián)用(UPLC-DAD-QTOF-MS)技術檢出某保健酒中非法添加了一種磷酸二酯酶-5(PDE-5)抑制劑衍生物，經制備液相色譜分離純化，采用UPLC-DAD-QTOF-MS、核磁共振(NMR)和紅外光譜(IR)技術對其進行了分析和結構鑒定，確定其為一種新型艾地那非衍生物，國內外均未見報道。

磷酸二酯酶-5(PDE-5)抑制劑衍生物；UPLC-QTOF-MS；NMR；IR；結構鑒定

磷酸二酯酶-5(PDE-5)抑制劑是一類應用廣泛的治療男性勃起功能障礙(ED)類藥物，臨床用藥主要有西地那非、伐地那非和他達拉非3種。一些不法分子為了謀取暴利，利用人們相信中藥和保健品是純天然無毒副產品、可長期服用的心理，在中成藥和保健食品中非法添加PDE-5抑制劑類化合物，對服用者安全造成嚴重隱患。國家食品藥品監(jiān)督管理局于2009年頒布了補腎壯陽類中成藥中11種PDE-5抑制劑的檢驗方法，然而不法分子為規(guī)避技術監(jiān)管，新型的PDE-5抑制劑衍生物層出不窮，而檢驗方法明顯滯后，在監(jiān)督檢驗中極易造成“假陰性”的結果。

隨著對PDE-5抑制劑衍生物的不斷研究，新發(fā)現(xiàn)的PDE-5抑制劑衍生物[1-6]越來越多。目前已報道的PDE-5類化合物主要是在西地那非、他達拉非、伐地那非、紅地那非、艾地那非等化合物的官能團上進行結構修飾而得到的相應衍生物，如硫代西地那非是西地那非嘧啶環(huán)上的氧被硫取代，氨基他達拉非是他達拉非吡嗪環(huán)氮上的甲基被氨基取代，N-去乙基伐地那非是伐地那非哌嗪環(huán)氮上的乙基被消去，羥基紅地那非是紅地那非哌嗪環(huán)氮上的乙基被羥基乙基取代，苯丙氧基艾地那非是艾地那非苯環(huán)上的乙氧基被丙氧基取代。結構修飾呈多樣化趨勢，在監(jiān)督檢驗中易發(fā)生漏檢現(xiàn)象。筆者團隊采用UPLC-DAD-QTOF-MS技術，在宣稱具有壯陽作用的某保健酒中發(fā)現(xiàn)一種新型艾地那非類化合物，經制備液相色譜分離純化后，進行紫外光譜、質譜、紅外光譜和核磁共振光譜解析，確認為一種新型PDE-5抑制劑衍生物，目前國內外均未見報道。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

AB TripleTOF?5600+高分辨四極桿飛行時間質譜(美國AB公司)，島津LC-30A超高效液相色譜儀(日本島津公司);Waters制備液相色譜(美國Waters公司)；AVANCE-600超導核磁共振儀(瑞士布魯克公司)；NICOLET iS 50 FT-IR傅立葉變換紅外光譜儀(美國Thermofisher公司)；甲醇(色譜純，Merck公司),乙酸(色譜純，F(xiàn)isher公司)，乙酸銨(Sigma公司，純度≥99.99%)，實驗用水為超純水，其他試劑均為分析純。樣品為購自超市的某保健酒。

1.2 UPLC-DAD-QTOF-MS檢測條件

Shimadzu Shim-pack XR-ODS色譜柱(100 mm×2.0 mm,2.2 μm)，流動相為含0.1%乙酸的0.01 mol/L 乙酸銨溶液(A)-乙腈(B)。梯度洗脫程序：0～8 min，27%B；8～18 min，27%～80%B；18～20 min，80%B；20～21 min，80%～27%B；21～25 min，27%B。流速0.3 mL/min；波長掃描范圍200～400 nm。

質譜條件：電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描，掃描方式：一級質譜全掃描，掃描范圍為m/z100～1 000；二級質譜全掃描，掃描范圍為m/z40～1 000。離子源參數(shù)：霧化氣為高純氮氣，GS1為55 psi，GS2為55 psi，CUR GAS為30 psi，離子源溫度(550 ℃)，電噴霧電壓為5 500 V，去簇電壓為80 V，碰撞能量為24 V。CDS自動校準(校準液為AB公司APCI positive calibration solution)。

1.3 制備HPLC條件

SunFire Prep C18OBD制備色譜柱(19 mm ×100 mm,5 μm)；流動相為甲醇-水，流速為10 mL/min，紫外檢測器，波長為230 nm，進樣量為200 μL。

1.4 NMR條件

溶劑為氘代氯仿(CDCl3)，內標為四甲基硅烷(TMS)，測試溫度為298.5 K,1H NMR共振頻率為 600 MHz,13C NMR共振頻率為 150 MHz。

1.5 IR條件

溴化鉀壓片，掃描范圍為4 000～400 cm-1。

1.6 樣品制備

1.6.1 UPLC-DAD-QTOF-MS 精密吸取保健酒樣品1 mL，置于50 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

1.6.2 制備HPLC 取保健酒適量進行旋蒸濃縮，當殘留溶劑約為5 mL時過濾進樣，收集主成分色譜峰，減壓蒸發(fā)除去溶劑，即得純化物。

1.6.3 NMR 取制備得到的純化物約15 mg，用0.5 mL氘代氯仿溶解至核磁共振測試管中。

1.6.4 IR 取制備得到的純化物約5 mg，與適量KBr混勻，研細，壓片。

2 結果與討論

2.1 UPLC-DAD-QTOF-MS分析

按國家藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目批準件(批準件編號2009030)及參考文獻[7-15]，建立了UPLC-DAD-QTOF-MS檢測緩解體力疲勞及補腎壯陽類藥物PDE-5 抑制劑數(shù)據(jù)庫，通過特征碎片離子篩查，發(fā)現(xiàn)該保健酒樣品中有一響應較高但準分子離子峰與數(shù)據(jù)庫不匹配的未知峰(見圖1)，其紫外吸收光譜圖與西地那非和艾地那非有一定的相似度。此未知峰的[M+H]+精確分子量為531.274 6，同位素豐度比m/z531∶532∶533∶534=100∶31.59∶14.95∶1.3；其m/z小于300的碎片離子與西地那非及艾地那非基本一致，其中包含有m/z113艾地那非(衍生物)的特征碎片離子，因此綜合未知物的紫外光譜和一級、二級質譜信息，推斷該未知物為艾地那非衍生物。

圖1 未知物的圖譜Fig.1 Spectrum of unknown compound

綜合同位素、精確分子量以及碎片離子信息分析，通過Formulafinder軟件，篩查出其分子式為C26H38N6O4S，此化合物的同位素相對豐度比理論值為m/z531∶532∶533∶534=100∶32.49∶10.34∶2.18，實驗值與理論值基本一致，匹配度達97.1%。該衍生物比艾地那非(C23H32N6O4S)多3個CH2單元，比文獻[3]報道的丙氧基苯基艾地那非Propoxyphenyl aildenafil(C24H34N6O4S) 多2個CH2單元(見圖2)。經質譜圖比對，發(fā)現(xiàn)該衍生物除本身的準分子離子峰m/z531([M+H]+峰)外，其它離子碎片與Propoxyphenyl aildenafil基本一致(見表1),由此推測該衍生物是在Propoxyphenyl aildenafil基礎上(結構見圖3)進行了結構改造。

圖2 艾地那非和propoxyphenyl aildenafil[3]的二級質譜圖Fig.2 MS2 spectra of aildenafil and propoxyphenyl aildenafil[3]

圖3 西地那非、艾地那非、propoxyphenyl aildenafil[3]的分子結構Fig.3 Molecular structures of sildenafil,aildenafil and propoxyphenyl aildenafil[3]

Table 1 UPLC-QTOF-MS data for sildenafil,aildenafil,propoxyphenyl aildenafil[3]and unknown

NameFormulaExtractionmass(Da)Foundatmass(Da)Error(ppm)MS2SildenafilC22H30N6O4S475212247521220475，311，299，283，254，99AildenafilC23H32N6O4S4892278489228921489，432，377，311，299，283，254，166，113，99Propoxyphenylaildenafil[3]C24H34N6O4S50324355032418-34503，391，325，299，283，113，99UnknownC26H38N6O4S53127485312745-06531，503，391，325，311，299，283，254，166，113，99

2.2 NMR結構解析

2.2.1 氫譜信號峰的解析 由質譜分析可知未知物的元素組成為C,H,O,N,S 5種元素，其分子式為C26H38N6O4S。核磁共振譜有一維譜圖(1H NMR,13C NMR,DEPT135,DEPT90)和二維譜圖(1H-1H COSY,HMQC,HMBC)，具體圖譜見圖4。

圖4 未知物的核磁共振圖譜

Fig.4 NMR spectra of unkonwn compounds

13C譜顯示未知物含23個C，結合DEPT135可知，此化合物含有8個季C,由其分子式為C26H38N6O4S分析，可得出該化合物含有3組對稱C原子；由1H譜可知，δ8.13(s,1H)、δ7.75(d,1H)、δ7.09(d,1H)、δ4.69(q,2H)、δ4.24(s,3H)、δ4.06(t,2H)、δ3.63(d,2H)、δ2.99(m,4H)、δ1.89(m,4H)、δ1.80(m,2H)、δ1.50(t,3H)、δ1.03(m,12H)，共37個氫，含1個活潑氫。氫信號峰的分析見表2。

表2 氫譜信號峰的分析

Table 2 Analysis of1H NMR data

1HNMR(ppm)1H-1HCOSY(ppm)HMQC(ppm)13CDEPT135Structureδ813δ775δ13185CH(15)δ775δ813，δ709δ12993CH(17)δ709δ775δ11264CH(18)δ424-δ385CH3(10)-X1-CH3δ469δ150δ628CH2(a)-X2-CH2CH3δ150δ469δ144CH3(b)δ406δ180δ704CH2(20)-X3-CH2CH2CH3δ180δ406，δ103δ224CH2(21)δ103δ180δ106CH3(22)δ299δ189δ279CH2(11)-CH2CH2CH3δ189δ299，δ103δ225CH2(12)δ103δ180δ141CH3(13)δ362[2]，δ189δ189，δ362δ528CH2(25，29)δ299δ362，δ102δ503CH(26，28)δ103δ299δ193CH3(30，31)

[2]分析認為，δ3.62與δ1.89處質子數(shù)為4的多重峰，H-H COSY顯示此兩組峰互為強相關，HMQC譜、碳譜、DEPT譜顯示該峰與亞甲基譜線δ52.8直接相關，即該碳譜包含兩個亞甲基碳，此兩個亞甲基處于對稱的結構上。其氫譜化學位移不一致是因為亞甲基處于環(huán)上的結構位置，直立鍵氫與平伏鍵氫的空間化學環(huán)境不同使得氫譜上的化學位移不同，所以歸屬為25和29位亞甲基。

2.2.2 季碳譜信號峰的解析 季碳信號峰的歸屬見表3。

表3 季碳信號峰的分析

Table 3 Analysis of13C NMR data

13CNMR(ppm)HMBC(ppm)13CStructureδ1607δ709(18)，δ406(20)，δ813(15)，δ775(17)C(19)δ1557δ469(a)，δ424(10)C(7)δ1462δ299(11)C(9)δ1444δ299(11)，δ189(12)，δ424(10)C(3)δ1553δ469(a)，δ813(15)，δ709(18)C(5)δ1211δ424(10)C(8)δ1266δ709(18)，δ813(15)，δ775(17)C(14)δ1296δ813(15)，δ775(17)，δ709(18)C(16)

圖5 NMR的解析結構圖Fig.5 Structure of NMR analysis

綜上分析，此化合物含有兩個結構片段，片段1(結構B)與片段2(結構C)。依據(jù)元素價鍵理論分析，X1與3位C間應有一雜原子X6；9位C與5位C間有一雜原子X7相連，如圖5所示結構D，從質譜分析可知X1，X6，X7在S，O，N中選擇N原子最為合理。

2.3 IR解析

通過紅外光譜圖可確定此未知物存在的一些官能團(見表4)。因此由25位氫δ值為3.62，26位氫δ值為2.99可知，24位所連官能團為磺?；?；片段1中X4應為N元素，所連基團為N—SO2—R；片段1與片段2通過磺?；噙B；X5為N元素所連活潑氫，因此可確定該未知物的結構，其分子式為C26H38N6O4S。通過與艾地那非的結構進行比對，發(fā)現(xiàn)此化合物為艾地那非19位上的乙氧基被丙氧基取代，6位N原子上的活潑氫被乙基取代后的衍生物。與Propoxyphenyl aildenatil的結構進行比對，則此化合物為Propxyphenyl aildenatil 6位N原子上的活動氫被乙基取代后的衍生物。

表4 紅外光譜數(shù)據(jù)分析

Table 4 Analysis of IR data

σ/cm-1VibrationFunctiongroup2961～2874亞甲基、甲基的C—H伸縮振動亞甲基和甲基1457C—H的變形振動亞甲基和甲基1647C‖O伸縮振動酰胺1608C‖N的振動氮雜環(huán)1576，1505苯環(huán)骨架中C‖C振動苯環(huán)1417氮甲基(N—CH3)的振動吸收氮甲基1318酮基的不對稱吸收磺?；?264不飽和醚鍵(‖C—O—)的振動吸收不飽和醚鍵1163磺?；?RSO2—N—)的振動吸收磺酰基

3 結 論

本文通過建立的UPLC-DAD-QTOF-MS檢測方法和數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)某保健酒中未知物的二級碎片中有PDE-5抑制劑的特征碎片，其紫外吸收光譜與西地那非、艾地那非相似，且實驗獲得的同位素豐度比與Formulafinder軟件篩查出的分子式(C26H38N6O4S)理論值基本一致，從而確定了分子元素組成。再進一步用制備液相色譜進行了分離純化，將得到的純化品進行NMR和IR分析，最終確定未知物的結構。此未知物是在艾地那非的基礎上進行了結構修飾：19位上的乙氧基被丙氧基取代，6位N原子上的活潑氫被乙基取代，此未知物為一種新型艾地那非衍生物，國內外均未見報道。此種結構修飾的PDE-5抑制劑是非法添加的新趨勢，應引起足夠的重視。

近年來，不法分子為逃避監(jiān)管，采用高科技造假，檢驗機構不斷檢出新型PDE-5抑制劑，綜合分析近年來PDE-5抑制劑衍生物的種類，常見在O和N上進行結構修飾，通常為短鏈的甲基、乙基、丙基取代，因此當準分子離子峰不同，但二級碎片中出現(xiàn)PDE-5抑制劑的基本母核的特征碎片時，應給予特別的關注。

致謝：衷心感謝本院郭永輝博士以及石藥集團中奇制藥有限公司對本實驗提供的幫助。

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Discovery and Structure Identification of a New Phosphodiesterase-5 Inhibitor Derivative

MA Chun-yan,DUAN Qiong,FENG Shu-hua*

(Hebei Institute for Drug Control,Shijiazhuang 050011,China)

One suspected phosphodiesterase-5 inhibitor(PDE-5) derivative was found in a kind of medicinal liquor by UPLC-DAD-QTOF-MS.Sample purification was carried out by a preparative HPLC system，and its structure was determined by NMR,IR and UPLC-DAD-QTOF-MS methods.The results showed that the compound is a new aildenafil derivative which has never been reported at home and abroad.

PDE-5 inhibitor analogue;UPLC-QTOF-MS;NMR;IR;structure identification

2015-11-26；

2015-12-17

河北省食品藥品監(jiān)督管理局重點科技項目(ZD2014006)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.05.009

O657.65；TQ460.72

A

1004-4957(2016)05-0551-06

*通訊作者：封淑華，碩士，主任藥師，研究方向：保健食品和藥物分析，Tel：0311-89892090，E-mail：shuhua08@sina.com