超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定中藥制劑中松香酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸及蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的含量

王 璐，劉成雁，王志嘉，任雪冬，吳冬冬，尤海丹，熊 爽

(遼寧省分析科學研究院 遼寧省標準化體系建設工程技術研究中心 遼寧省分析測試技術

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超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定中藥制劑中松香酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸及蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的含量

王 璐，劉成雁*，王志嘉，任雪冬，吳冬冬，尤海丹，熊 爽

(遼寧省分析科學研究院 遼寧省標準化體系建設工程技術研究中心 遼寧省分析測試技術

建立了快速檢測中藥制劑中松香酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸、蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的超高效液相色譜-串聯質譜方法。樣品以甲醇為提取溶劑，經Zorbax SB-C18色譜柱分離，以乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相梯度洗脫，流速為0.3 mL/min；采用電噴霧離子源(ESI)，正離子多反應監測(MRM)掃描方式檢測；基質匹配標準曲線法定量。結果表明，6種化合物分別在3.0～100 μg/L(蘇丹紅Ⅰ，Ⅱ)及30～1 000 μg/L(松香酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸及蘇丹紅Ⅲ，Ⅳ)范圍內線性關系良好，相關系數均大于0.99，方法檢出限為0.7～8.6 μg·kg-1，定量下限為2.2～25.1 μg·kg-1。低、中、高3個加標水平下各化合物的平均回收率為76.5%～94.9%，相對標準偏差(RSD)為2.3%～9.9%。采用酸化提取液的方法解決了蘇丹紅Ⅲ和Ⅳ的光學異構現象帶來的計算誤差。通過對目標化合物碎片離子的研究以及質譜裂解規律的總結，為其定性鑒別和定量分析提供了參考。該方法操作簡便、準確、快速、靈敏，適合摻假中藥制劑中松香酸及蘇丹紅含量的檢測。

超高效液相色譜-串聯質譜法；松香酸；11-羰基-β-乙酰乳香酸；蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ；中藥制劑

乳香、沒藥、血竭具有調氣活血、舒筋活絡、消腫散結等功效，適用于各種跌打損傷[1]。乳香與沒藥均為樹脂類藥材，乳香中的主要特征成分為11-羰基-β-乙酰乳香酸，目前主要依靠進口，來源有限，價格較高。經市場調查，常有用松脂或松香摻假的乳香、沒藥銷售[2-3]。松香的主要成分為松香酸，屬萜類化合物，有小毒，中醫臨床多為外用，少內服。因此藥品中添加松香不僅降低藥效，還具有一定的安全風險。劣質血竭藥材常用蘇丹紅染色，以改善外觀，提高售價。蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ原型及其代謝產物均有一定的潛在致癌作用，我國已禁止其作為色素添加劑在食品中使用。由此可見，偽劣中藥嚴重影響患者健康甚至危及生命，必須加強中藥摻假的打擊力度。

近年來對松香酸和乳香酸的檢測，主要有高效液相色譜法(HPLC)[4-5]、薄層色譜法(TLC)等[6-7],但其靈敏度低，選擇性和特異性較差。針對蘇丹紅的檢測方法主要有HPLC[8]、液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)[9-14]和氣相色譜-質譜法(GC-MS)[15]等，但其測定的樣品多為辣椒制品、調味品、熟食、蛋禽類等食品，鮮見測定中藥中非法添加蘇丹紅染色劑的報道[16-17],而關于同時測定中藥制劑中松香酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸及蘇丹紅的方法尚未見報道。

本研究首次建立了同時快速測定中藥制劑中松香酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸及蘇丹紅Ⅰ ～ Ⅳ的UPLC-MS/MS法。由于蘇丹紅為偶氮化合物，在光照條件下，蘇丹紅Ⅲ和Ⅳ產生兩個順反異構體，易造成測定結果不準確[18]。實驗采用酸化提取液的方法解決了蘇丹紅光學異構現象帶來的計算誤差。并首次推斷松香酸及11-羰基-β-乙酰乳香酸的質譜裂解方式，通過對化合物特征碎片離子的研究，為陽性樣品的定性分析提供了有利參考。該法前處理簡單，分析速度快，靈敏度高，重現性好，為評價中藥質量，監測中藥摻假問題提供了有效的質量控制手段。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200 UPLC/6410 B MS/MS 液相色譜-串聯四極桿質譜聯用儀(安捷倫科技有限公司)；KQ3200DB型超聲清洗器(江蘇昆山超聲儀器有限公司)；乙腈、甲醇(色譜純，美國Fisher Scientific公司)；甲酸(HPLC級，美國Tedia公司)；實驗用水為Milli-Q純水系統(Millipole公司)制備的超純水；對照品：松香酸、乳香酸、蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2 標準溶液的配制

由表2可以看出，10種有機防曬劑均有刺激，特別是PBSA和BP3呈現強刺激性；MBC、OCR、HMS的IS值相對略低，刺激性稍微低一些；EHMC、EHDP、BEMT、BMDM的IS值較低，刺激性相對更低。有機防曬劑或多或少都會帶來眼部刺激，刺激感的強弱除了與防曬劑種類有關外，還同用量有關，特別是SPF值高的防曬產品。因此產品開發人員在設計產品配方時，除了考慮SPF、PA對防曬產品的貢獻外，還應充分考慮各種防曬劑的特點，盡量選取刺激性相對小，相對溫和的防曬劑進行搭配使用。

標準儲備液：準確稱取上述標準品各5.0 mg，用甲醇溶解并定容至50 mL棕色容量瓶中，配成 1.0 mg/mL的標準儲備液，于-20 ℃冰箱中保存。

標準工作曲線：實驗過程中用5%的酸化甲醇稀釋上述標準儲備液，分別配成質量濃度為3～100 μg/L(蘇丹紅Ⅰ,Ⅱ)，30～1 000 μg/L(松香酸、乳香酸、蘇丹紅Ⅲ，Ⅳ)的混合標準工作液，現用現配。

基質匹配混合標準溶液：取不含目標化合物的陰性中藥樣品，按“1.3”樣品前處理后作為標準溶液的稀釋液，配制成不同質量濃度的混合標準溶液。

1.3 樣品處理

準確稱取0.2 g(或0.2 mL)樣品于10 mL容量瓶中，加入適量甲醇，超聲處理30 min，放冷，加入0.5 mL 5%甲酸溶液及適量甲醇至刻度，搖勻，過0.20 μm微孔濾膜，上機測定。

1.4 實驗條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱:Zorbax SB-C18色譜柱(2.1 mm×150 mm,3.5 μm)；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～3 min,15% A；3～4 min,15%～5% A；4～10 min，5% A；10～11 min，5%～15% A；11～12 min,15% A；流速為0.3 mL/min；柱溫 30 ℃；進樣量10 μL。

1.4.2 質譜條件 離子源為電噴霧(ESI)離子源，正離子電離模式；干燥氣(N2)溫度350 ℃，干燥氣流量 9.0 L/min；霧化氣(N2)壓力295.4 kPa；電噴霧電壓4 000 V；掃描方式為多反應監測(MRM)模式，其他質譜參數見表1。

表1 6種化合物的質譜條件參數

Table 1 UPLC-MS/MS parameters of 6 compounds

CompoundtR(min)Parention(m/z)Productions(m/z)Fragmentor(Ⅴ)Collisionenergy(Ⅴ)Abieticacid(松香酸)4730321232?，25719010，10Boswellicacid(乳香酸)6351311731?，407118060，50SudanⅠ(蘇丹紅Ⅰ)332491932?，15628020，25SudanⅡ(蘇丹紅Ⅱ)5427721560?，12118512，20SudanⅢ(蘇丹紅Ⅲ)7835321962?，15619022，20SudanⅣ(蘇丹紅Ⅳ)1063812912?，22428020，20

* quantitative ion

圖1 6種化合物的總離子流圖Fig.1 MRM chromatogram of six compounds1.Sudan Ⅰ,2.abietic acid,3.Sudan Ⅱ,4.boswellic acid,5.Sudan Ⅲ,6.Sudan Ⅳ

2 結果與討論

2.1 液相色譜條件的優化

考察了有機相溶劑(甲醇和乙腈)與水及不同種類的揮發性緩沖液作為流動相時對待測物的分離效果和離子化程度的影響。通過比較發現，有機相為乙腈時分離效果明顯優于甲醇，且能顯著縮短分析時間。實驗對比了乙腈-0.1%甲酸水和乙腈-5 mmol/L乙酸銨對待測物靈敏度的影響。結果顯示，在ESI(+)模式下流動相中加入0.1%甲酸，可提高目標化合物的離子化效率和靈敏度，因此采用乙腈-0.1%甲酸水作為流動相進行梯度洗脫。按“1.4.1”色譜條件,6種化合物在12 min內獲得較好的分離效果，結果見圖1。

2.2 質譜條件的優化及裂解規律的研究

分別配制濃度為500 μg/L的標準溶液，在正負模式下選擇適當的電離方式。乳香酸和松香酸在正負模式下均可帶電，而蘇丹紅為偶氮類化合物,容易帶正電荷，因此選擇ESI(+)作為離子化模式。分別找出這6種化合物的[M+H]+準分子離子峰，并對干燥氣體、霧化器壓力、干燥氣流量等參數進行優化，然后對母離子進行碰撞誘導解離，選擇2個信噪比較高的特征子離子分別作為定量、定性離子對。在ESI(+)-MS/MS 條件下,松香酸主要發生羥基、羧基和開環斷裂，形成碎片離子m/z285，257，149 和123，其中m/z123的豐度最高；乳香酸主要脫掉甲酸、乙酸分子及開環斷裂，形成碎片離子m/z173，407。蘇丹紅主要是羥基、偶氮基和C—N鍵斷裂形成子離子，由于它們屬于偶氮化物，結構相似，故在偶氮基斷裂時產生相同的碎片離子峰m/z156。6種化合物具體的斷裂方式如圖2所示。

Fig.2 MS spectra and fragmentation pathways of 6 compounds

圖3 偶氮化合物E-Z順反互變異構(A)和質子互變異構(B)Fig.3 Azobenzene and its E-Z isomerization(A), azo-hydrazone prototropic tautomerism(B)

2.3 蘇丹紅的光學異構現象及穩定性考察

實驗發現蘇丹紅Ⅲ、Ⅳ在不同的保留時間(3.5 min,7.8 min)、(4.7 min,10.6 min)出現雙峰，而蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ為單峰。這是由于蘇丹紅分子結構中含有氮-氮雙鍵，在光照條件下會發生E-Z順反互變異構現象(見圖3A)，使蘇丹紅Ⅲ、Ⅳ有兩個順反異構體，色譜分離時有雙峰現象。而蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ主要發生質子化互變異構(見圖3B)，所以只產生單個色譜峰[18-19]。由于順反異構體的存在會對蘇丹紅含量測定帶來10%～30%的定量誤差[18]。為解決此問題，文獻[19-20]提出避光放置24，12 h后進行測定，劉正才等[21]提出堿化定容液后進行測定。

本研究發現，酸性、堿性溶液均可催化E-Z構象互變轉化加快，使第一峰消失，但在酸性條件下的檢測靈敏度高于堿性條件，且在堿性溶液中松香酸和乳香酸的出峰完全變形。因此，最終選擇在酸性條件下解決蘇丹紅Ⅲ、Ⅳ的光學異構現象。實驗考察了不同含量的甲酸(0.5%,1%,2%,5%和10%)對異構化的影響，結果顯示，隨著酸度的增加，第一個色譜峰逐漸減小，第二個色譜峰不斷增加，當甲酸含量超過5%時，第一個色譜峰基本消失。

進一步考察了各化合物在5%酸化甲醇溶液中的穩定性。取同一濃度的標準品混合溶液(50 μg/L)，平行3份，分別放置0，0.5，1，2，4，8，10，12 h后上機測定。結果表明，放置超過8 h后，蘇丹紅Ⅲ和Ⅳ的第二色譜峰面積減小，逐漸出現雙峰現象，而在8 h內6種化合物的穩定性良好。

2.4 體系的基質效應

基質效應(ME%)=(基質匹配標準溶液曲線的斜率/標準溶液工作曲線的斜率-1)×100%。由公式可知，ME>0，產生基質增強效應；ME<0，產生基質抑制效應；ME=0，則無基質效應。采用空白基質溶液和溶劑分別配制相同濃度的標準溶液，對6種化合物進行基質效應的評價。結果表明：6種化合物均存在不同程度的基質抑制效應(-1.5% ～-36%)。實驗最終采用基質加標法定量以補償基質效應的影響。

表2 6種化合物的基質效應評價

Table 2 Evaluation of matrix effects of 6 compounds

CompoundSlopofcalibrationcurver2Slopofmatrix?matchedcalibrationcurver2Matrixeffect(%)Abieticacid201409973143109976-28Boswellicacid259709992165709994-36SudanⅠ296309952272709986-80SudanⅡ811809974799909985-15SudanⅢ613509983569409991-72SudanⅣ333809945315909913-54

2.5 線性范圍、檢出限與定量下限

采用空白基質分別配制質量濃度為30～1 000 μg/L(松香酸、乳香酸、蘇丹紅Ⅲ，Ⅳ)及質量濃度為3.0～100 μg/L(蘇丹紅Ⅰ，Ⅱ)的混合標準溶液，以各組分的峰面積(Y) 對其質量濃度(X,μg/L)繪制標準曲線。結果顯示，各化合物在相應的質量濃度范圍內具有良好的線性關系，相關系數(r2)均大于0.99(見表2)。樣品基質中分別以3倍信噪比(S/N≥3)及10倍信噪比(S/N≥10)進行計算，得到方法的檢出限(LOD)為0.7～8.6 μg·kg-1，定量下限(LOQ)為2.2～25.1 μg·kg-1(見表3)。

2.6 回收率與相對標準偏差

取6份空白的中藥樣品進行加標回收實驗，分別對其添加低、中、高3個濃度水平的標準溶液，每個水平做6個平行，結果見表3。6種化合物的平均回收率為76.5%～94.9%，相對標準偏差(RSD)均不大9.9%，方法顯示了較好的準確度和精密度。

表3 空白基質中6種化合物的加標回收率、相對標準偏差、檢出限及定量下限(n=6)

Table 3 Recoveries,RSDs，LODs and LOQs of 6 compounds in spiked blank sample(n=6)

CompoundSpiked(μg·L-1)Recovery(%)RSD(%)LOD(μg·kg-1)LOQ(μg·kg-1)Abieticacid50，200，800895，916，94731，56，4671212Boswellicacid50，200，800845，833，90479，61，3570207SudanⅠ50，20，80801，821，89742，58，990927SudanⅡ50，20，80909，916，94977，83，230722SudanⅢ50，200，800884，863，88233，32，4485245SudanⅣ50，200，800765，783，80792，91，7186251

2.7 實際樣品的測定

應用本方法對市售的15批根痛平膠囊、骨筋丸膠囊、活血接骨膠囊進行測定，均檢出乳香酸的特征成分11-羰基-β-乙酰乳香酸，其中2批檢測出松香酸,蘇丹紅染料未檢出。結果表明,存在用松香冒充乳香投料的問題，應引起重視。

3 結 論

本文建立了檢測中藥制劑中松香酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸、蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ含量的超高效液相色譜-串聯質譜法。方法靈敏度高、操作簡便，具有很好的實際應用價值，為中藥打假提供了有效手段，同時還能輔助高效液相色譜法來確證陽性樣品。

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Simultaneous Determination of Abietic Acid,Acetyl-11-keto-β-boswellic Acid and Sudan Ⅰ-Ⅳ in Traditional Chinese Medicine by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

WANG Lu,LIU Cheng-yan*,WANG Zhi-jia,REN Xue-dong,WU Dong-dong，YOU Hai-dan,XIONG Shuang

(Liaoning Key Laboratory of Analysis and Testing Techniques,Liaoning Research Center of Engineering and Technology of Standardization Construction,Liaoning Academy of Analytical Science,Shenyang 110015,China)

An ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric(UPLC-MS/MS) method was established for the simultaneous determination of abietic acid,acetyl-11-keto-β-boswellic acid and Sudan Ⅰ-Ⅳ in traditional Chinese medicine.The sample was extracted with methanol,and then separated on a Zorbax SB-C18(3.5 μm,2.1 mm×150 mm) chromatographic column using a mixture of acetonitrile and 0.1% formic as mobile phase by gradient elution at a flow rate of 0.3 mL/min.The electrospray was operated in the positive mode under the multiple reaction monitoring(MRM) mode,and the quantitation was carried out by the matrix standard curve.As a result,the calibration curves for Sudan Ⅰ/Ⅱ were linear in the range of 3.0-100 μg/L,and for the others were linear in the range of 30-1 000 μg/L.The correlation coefficients for all the compounds were greater than 0.99.The limits of detection(LOD) ranged from 0.7 μg·kg-1to 8.6 μg·kg-1,and the limits of quantitation(LOQ) ranged from 2.2 μg·kg-1to 25.1 μg·kg-1.The average recoveries of six compounds at three spiked levels were in the range of 76.5%-94.9% with relative standard deviations(RSD) of 2.3%-9.9%.It was demonstrated that the first peak would not appear if the sample was kept in methanol-5% formic acid solution which could be avoided 10% errors in quantitative analysis for Sudan Ⅲ and Sudan Ⅳ.Moreover,the mass spectrometric behaviour and the ion fragmentation patterns of six compounds could provide beneficial references for the qualitative identification and quantitative analysis.This method is simple,rapid and accurate,and is suitable for the rapid determination of abietic acid,acetyl-11-keto-β-boswellic acid and Sudan Ⅰ-Ⅳ in traditional Chinese medicine.

ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS)；abietic acid;acetyl-11-keto-β-boswellic acid；Sudan Ⅰ-Ⅳ;traditional Chinese medicine

2015-11-03；

2015-11-10

國家自然科學基金項目(21307051)；遼寧省自然科學基金項目(2013020152)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.05.005

O657.63;TQ460.72

A

1004-4957(2016)05-0526-06

*通訊作者：劉成雁，博士，研究員，研究方向：危險化學品的快速分析方法和應急處理，Tel：024-24823748，E-mail:chengyanliuln@163.com