建立監測核酸檢測系統趨勢變化方法的探討

莊養林，熊麗紅，施橋發

(1、江西省血液中心，江西南昌330057；2、南昌大學醫學院，江西南昌330006)

·輸血與檢驗·

建立監測核酸檢測系統趨勢變化方法的探討

莊養林1，2，熊麗紅1，施橋發2

(1、江西省血液中心，江西南昌330057；2、南昌大學醫學院，江西南昌330006)

目的探討羅氏核酸檢測試劑在多臺核酸檢測設備應用時建立室內質量控制措施，監測核酸檢測設備試驗的穩定性。方法應用羅氏核酸檢測試劑在羅氏Cobas S201核酸檢測系統上對無償獻血標本、核酸檢測試劑盒陽性對照品、核酸弱陽性室內質控品進行檢測，記錄每臺檢測設備的陽性對照品和弱陽性室內質控品的各檢測項目通道的Ct值。應用Excel繪制質量控制圖，以檢測日期為橫坐標，各個項目檢測Ct值為縱坐標，形成每臺檢測設備的各檢測項目的質控分析圖，通過對各檢測設備陽性對照品和弱陽性室內質控品的Ct值標準差、均值，評價各檢測設備檢測的穩定性。結果各檢測設備的陽性對照品及室內質控品的CV值均在5%以內，1A檢測設備與1B檢測設備比較時，各檢測項目P>0.05，1B檢測設備與2號檢測設備比較時，各檢測項目P>0.05，1A檢測設備與2號檢測設備比較時，各檢測項目P>0.05，均無顯著性差異。結論各檢測設備間檢測性能無明顯差異，本實驗室參照定量數據模式所建立的室內質量控制措施用以監測核酸檢測系統趨勢變化的方法具有一定的意義。

核酸檢測技術；Ct值；羅氏CobasS201核酸檢測系統；試驗穩定性

核酸檢測技術（NAT）在我國應用于采供血機構進行血液篩查的試點工作在2010年啟動，隨著血站核酸檢測工作的全面覆蓋以及對血液管理工作要求的提高，為了規范核酸檢測的操作流程，進一步提高輸血安全水平，國家衛計委組織專家對《血站技術操作規程（2012版）》進行了修訂和完善，主要增加和調整了核酸檢測有關內容，形成了《血站技術操作規程（2015版）》，其中在4.8.1.1條款中明確說明在血液檢測過程中，應對試驗性能持續進行監控，以發現正在發生的任何性能變化，這些變化如果沒有得到及時糾正，最終可能導致試驗批次的失敗，或者弱陽性標本的漏檢[1]，即監控試驗有效性和穩定性，監測系統的趨勢變化。對此，我們也進行了相關的監測工作，即統計各核酸檢測設備相關檢測項目通道記錄的Ct值（實時監測過程擴增過程的熒光信號達到指數擴增循環周期數）[2]，進行分析工作，現將有關工作介紹如下。

1 對象與方法

1.1 標本來源選自2016年3月1日-2016年3月31日南昌市無償獻血者標本；羅氏MPX V2.0核酸檢測試劑陽性對照品；北京康徹思坦生物技術有限公司核酸質控品，HBV-DNA（50IU/ml）、HCV-RNA（200IU/ml）、HIV-RNA（1000IU/ml）。

1.2 儀器羅氏公司Cobas s 201核酸檢測系統，瑞士Hamlton全自動STAR加樣儀，長沙湘麓DL-6M大容量低溫離心機。

1.3 主要試劑核酸檢測試劑盒：COBAS TaqScreen MPX V2.0 test核酸檢測試劑盒（瑞士Roche公司，批號：210761），該試劑可同時定性檢測人類血漿中的HIV-1，2 RNA、HCV RNA和HBV DNA。

1.4 實驗方法

1.4.1 弱陽性質控品的配制將原濃度的HBVDNA（50IU/ml）、HCV-RNA（200IU/ml）、HIV-RNA（1000IU/ml）三種弱陽性質控品各1ml匯集到一支試管中，加入2ml生理鹽水充分混勻，形成HBVDNA、HCV-RNA、HIV-RNA終濃度分別為10IU/ ml、40IU/ml、200IU/ml的混合弱陽性室內質控品，即各檢測項目在試劑檢測下的2~5倍濃度。

1.4.2 制作Levey-Jennings質控圖運用羅氏COBAS TaqScreen MPX V2.0 test核酸檢測試劑盒對無償獻血者標本進行檢測，每批次試驗帶有陽性對照品及使用康徹思坦公司原濃度配置的混合弱陽性室內質控品。試驗結束后應用Excel繪制Levey-Jennings質控圖，以檢測日期為橫坐標，以各個項目檢測Ct值為縱坐標，將各個項目檢測的Ct值分檢測設備繪制在一張Levey-Jennings質控圖上。具體做法為：將全部檢測設備的相應檢測項目的Ct值累積（大于20個）在一起，計算一個批號的陽性對照品及弱陽性室內質控品各項目的總均值及總標準差(SD)，剔除超過±3s的Ct值，重新計算各項目Ct值的總均值及總標準差，形成一個批號的陽性對照品及弱陽性室內質控品各項目的Levey-Jennings質控圖框架，隨后可將幾個月的全部檢測設備的各項目Ct值累積，計算出該批號陽性對照品及弱陽性室內質控品的各項目Ct值的總均值及總標準差，形成該批號的各項目的Levey-Jennings質控圖框架。每次試驗結束后只需將各儀器各項目檢測的Ct值輸入到Excel表格中即可得到該檢測項目在該檢測設備上的趨勢變化圖。

1.4.3 計算每臺檢測設備相應檢測項目的均值(x)、變異系數（CV）及標準差。

1.5 結果判定陰性對照檢測結果無反應性為陰性，陽性對照檢測結果反應性為陽性，室內質控品各檢測項目為反應性；每個混樣孔（pool）內標檢測結果陽性，本pool檢測結果有效；如混樣孔內標檢測結果陰性，本pool檢測結果無效；在陰、陽性對照品檢測結果及室內質控品結果均有效時判為本次試驗有效，否則為無效。如試驗無效，該標本需重新檢測。

1.6 統計學方法運用SSPS軟件對數據進行統計分析，組間比較采用t檢驗方法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 均值及標準差各核酸檢測設備各陽性對照品及弱陽性室內質控品均值及標準差見表1。

2.2 質控圖各儀器利用各項目累積總均值及總標準差建立框架形成的部分陽性對照品（CTL）及弱陽性室內質控品（QC）Ct值Levey-Jennings質控圖見圖1。

3 討論

實驗室采用日常各檢測項目的檢測結果來進行室內質控這種方法在臨床上，尤其是生化定量方面早已有大量運用，主要是將每天的某項檢測項目的結果均值繪制質控圖，以此來觀察檢測結果是否失控。但PCR的檢測結果與生化定量的檢測結果相比則不同，生化定量的檢測結果為計量資料，而定性PCR檢測結果則為計數資料，后者只有兩種結果：陰性或陽性。而且，目前國內采供血機構室內質控品均為低濃度，低濃度的質控品病毒或核酸片段在質控品中分布不均勻，其Ct值與與濃度并不成線性關系，若參照定量方法運用2~5倍LOD(檢測下限)濃度質控品進行室內質控，如不能保證質控品的質量以及實驗操作員嚴格按照操作規程操作，很容易造成失控現象。針對此種情況，目前國內采供血機構核酸實驗室普遍的做法是采用定性的方法進行質量控制。因核酸檢測技術應用于采供血血液篩查實驗中在我國還處在早期階段，如何進行核酸檢測的質量控制，進一步提高核酸檢測結果的準確性及可靠性也成為國內采供血機構核酸實驗室目前正在探索的階段，國內也有部分實驗室采用相似的方法進行了室內質量控制措施，也取得了一定的效果[3-5]。

表1 各核酸檢測設備各陽性對照品(CTL)及弱陽性室內質控品(QC)的均值及標準差

圖1 Levey-Jennings質控圖

本實驗室采用的核酸試驗室內質控的方法是將每天各檢測項目通道的檢測Ct值作為計量資料用于室內質控，采用定量數據模式進行質控分析。從三臺檢測設備累積的數據結果來看，每臺檢測設備的各個檢測項目的CV值都在5%以內，說明各個檢測設備各檢測項目的均數離散程度較好，試驗穩定性較好。通過各組數據間的比較（P> 0.05），反映了三臺檢測設備之間的差異均無明顯區別。通過上圖所示，本實驗室核酸試驗室內質控利用Levey-Jennings質控圖，在質控圖上正確顯示了各質控點，可直觀、實時分析血液篩查中核酸檢測定性項目的質控數據。繪制的各檢測項目Ct值Levey-Jennings質控分析圖可以清晰直觀地監測檢測設備趨勢變化，及時發現各檢測設備正在發生的任何性能變化、糾正不良因素。通過三臺檢測設備各個檢測項目的Ct值Levey-Jennings質控圖來看，除1B號檢測設備2016年3月4日室內質控品HBV-DNA項目和1B號檢測設備2016年3月16日室內質控品HIV-RNA項目Ct值出現在+3s外，其余各檢測設備及檢測項目Ct值均在+3s內。而3月4日室內質控HBV-DNA項目的Ct值為36.8，3月16日室內質控品HIV-RNA項目的Ct值為37.0，反映了室內質控品相應的病毒或核酸片段含量較低。在排除了實驗操作員的操作原因后，分析可能為病毒在質控品中的呈顆粒分布，在質控品中易分布不均勻導致檢測Ct值較高。因羅氏COBAS TaqScreen MPX V2.0 test核酸檢測試劑盒中陽性對照品及購買自康徹思坦公司核酸弱陽性質控品濃度是定量的，故各項目檢測Ct值理論上也應在一定范圍內波動。在排除人為操作因素影響的情況下，如陽性對照品實驗前是否充分搖勻、配置弱陽性室內質控品是否按標準操作進行配制等，若某檢測項目在某臺檢測設備上出現有檢測Ct值持續升高或降低，通過Levey-Jennings質控圖就可以直觀看到這種向上或向下的趨勢，及時去分析出現的問題，采取相應的措施以解決發現正在發生的任何性能變化。因此，通過監測陽性對照品以及弱陽性室內質控品的Ct值，定期對其進行分析，可以監控試驗有效性和穩定性，達到監測系統的趨勢變化的目的。

當然采用陽性對照品以及弱陽性室內質控品的Ct值作為監控核酸檢測的穩定性還是有一定的局限性的。前期我們已統計過相當量的數據，陽性對照品Ct值的CV一般都在2%以內，Ct值比較穩定難以觀察到檢測系統趨勢變化，且一個批號中會有偶發的個別陽性對照出現陰性的結果，追蹤檢測過程也無異常現象，從設備、人員操作、環境中都無法找出原因。另外使用弱陽性室內質控品作為監測指標也有一定的局限性，因為對用于室內質控購買的弱陽性質控品的要求也是很高的，一是質控品儲存過程中要比較穩定不易降解，二是購買的質控品標識的定量要比較準確，標識過低而實際濃度較高容易造成CV值變異較小，無法監測系統趨勢變化，而標識過高實際濃度較低容易造成CV值波動較大、甚至出現陰性結果，對監測核酸檢測試驗穩定性也無意義。例如我實驗室采用的是羅氏核酸檢測系統，HCV RNA平均95% LOD（檢測下限）僅為6.8IU/ml，室內質控品采用2~ 5倍LOD進行室內質控檢測時，若購買到濃度標識過高的質控品（實際濃度較低），就很容易造成CV值較大，室內質控失控，甚至檢出陰性結果的現象，無法起到實驗室質量控制的作用。

因此在定值濃度的質控品條件下，建立Levey-Jennings質控分析圖可以排除人員因素、環境差異所導致的誤差，能進一步提高實驗室核酸檢測結果的準確性及可靠性[6]。但實驗人員嚴格按照操作規程進行操作顯得尤為重要，一是注意實驗前的充分混勻，因室內質控品病毒核酸終濃度較低，僅為試劑檢測下限的2~5倍濃度，若不進行充分搖勻混勻很容易造成病毒核酸在質控品中分布不均勻，吸取檢測標本時僅有少量病毒核酸被吸取，造成Ct值過高，甚至病毒核酸檢測不出的現象。二是注意室內質控品切忌反復凍融及復融后放置過長時間，這些情況都容易造成病毒核酸破環及降解[7-10]，從而造成病毒核酸檢測Ct值過高[11]，甚至陽性質控品出現檢測陰性結果的現象。本文旨在探討羅氏核酸檢測試劑在多臺核酸檢測設備應用時，能否根據各陽性對照及室內質控品各檢測項目檢測的Ct值，參照定量數據分析的模式，建立Levey-Jennings質控分析圖，用以監測核酸檢測系統趨勢變化的方法，盡管有不完善的地方，但經過運行還是起到了提高實驗室質量控制的能力，在今后的工作中，我們也將持續完善實驗室室內質量控制措施，提高實驗室的檢測能力。

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Q751，R523

A

1674-1129(2016)06-0801-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2016.06.038

2016-04-08；

2016-12-08)