贛州地區HBV Enh-I/X基因啟動子的突變及對肝臟疾病進程的影響

肖九長，鄒淑慧，唐金鳳，劉 婷，范存琳，劉奕紅，劉 聰

(贛州市人民醫院，江西贛州341000)

贛州地區HBV Enh-I/X基因啟動子的突變及對肝臟疾病進程的影響

肖九長，鄒淑慧，唐金鳳，劉 婷，范存琳，劉奕紅，劉 聰

(贛州市人民醫院，江西贛州341000)

目的通過對HBV Enh-I/X基因啟動子序列的測定和比較，探討其突變與肝臟疾病進展的關系。方法收集125份乙型肝炎感染者的血清標本HBV-DNA，PCR擴增HBV Enh-I/X基因并測序，比較不同患者之間的突變差異。結果獲得HBV Enh-I/X基因42份，其中慢性乙型肝炎(CHB)20例，肝硬化（LC）14例，肝細胞癌（HCC）8例。突變率較高的位點有A1077C，A1123T和G1218C/A在CHB、LC及HCC組中的突變率分別為：20%、64.29%和50%；10%、50%和37.5%；50%、42. 9%和50%。對CHB、LC和HCC三組患者間進行比較，位點A1077C在LC組和HCC組的變異率為64.29%和50%，顯著高于CHB組（20%，χ2=7.076，P=0.029）；位點A1123T在LC組和HCC組的變異率為50%和37.5%，顯著高于CHB組（10%，χ2=7. 619，P=0.022）；位點A1317G在LC組和HCC組的變異率為35.71%和50%，顯著高于CHB組（5%，χ2=8.019，P=0.018）。結論HBV Enh-I/X基因啟動子序列上存在多位點的突變，可能影響轉錄水平及復制水平，使病情進展趨于復雜，了解其突變情況為乙型肝炎的治療和控制疾病發展提供病毒學分子信息。

乙型肝炎病毒；Enh-I；突變

乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）感染后可表現為乙肝攜帶者（AsC）、慢性乙型肝炎（CHB）、肝硬化（LC）甚至肝癌（HCC）[1，2]。HBV變異可影響慢性肝病的進展。HBV Enh-I/X基因啟動子位于nt955-1359，是HBV基因組的順式作用元件，包括調控區（nt955-1047），核心區（nt1048-1168）和X基因重疊區（nt1169-1359）[3]，可參與調控HBV基因組的轉錄與復制，其序列上的突變與HBV慢性感染的關聯尚不明確。贛州地區作為乙型肝炎的高發區，對乙肝病毒基因組的突變與疾病的關系研究較少，本研究對HBV Enh I/X基因啟動子進行序列分析，以探討變異對肝臟疾病進程的影響。

1 材料與方法

1.1 標本來源研究對象：以2015年6月至2015年12月間在贛州市人民醫院住院的慢性乙型肝炎患者為研究人群。共收集125份血清標本，男性82例，女性43例，年齡23~86歲，診斷標準符合2000年中華醫學會修訂的《病毒性肝炎防治方案》[4]，排除其他肝炎病毒（HAV、HCV、HDV、HEV）及CMV、HIV、EBV合并感染，無嗜酒史，無肝毒性藥物使用史，無脂肪肝及自身免疫性肝炎，入選對象均未使用核苷類似物和干擾素等藥物。所有患者HBV DNA均為陽性

1.2 HBsAg、HbsAb、HbeAg、HbeAb、HbcAb、PreS標志物采用中山生物工程有限公司試劑盒進行檢測。1.3 HBV DNA的提取和定量提取液及Real time PCR試劑盒購自中山大學達安基因股份有限公司。DNA的提取采用煮沸法（DNA提取液50μl加血清50μl，混勻后100℃水浴10min，12000r·min-1離心5min，上清備用)

1.4 HBV Enh I/X基因啟動子的擴增和序列測定。PCR擴增及測序引物：F1：5’-ttgtctttgggtatacatttgaa -3’；R1：5’-ggcagcacagcctagcagcc-3’，由上海invitrogen生物科技有限公司合成。TransTaq DNA Polymerase High Fidelity(HiFi)試劑盒及DNA Marker購自北京Transgen生物科技有限公司。PCR反應條件：95℃，5min+94℃，45s+55℃，45s+ 72℃，90s)×35循環→72℃，10min。PCR產物交上海Invitrogen生物科技有限公司測序。采用GenBank中Genotyping軟件對測序標本進行分型，所入選病例的基因分型已在前期工作完成。序列比對使用HBV B型(AF100309)為參照序列。利用ClustalX、Bioedit軟件對產物序列進行基因的突變分析。1.5統計學方法計量資料采用均數±標準差（x± s）表示，計數資料采用例數和百分比表示，使用SPSS 13．0軟件進行卡方檢驗，P<0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PCR擴增及測序結果將125份HBsAg、HBV DNA均為陽性標本進行PCR擴增，部分標本因病毒載量較低，PCR反應產物太弱無法滿足要求而未送測序。將擴增成功的PCR產物及相應的測序引物，委托Invitrogen生物科技有限公司進行DNA測序。獲得42份靶序列。

2.2 測序標本的一般情況42份測序成功的標本包括20例CHB，14例LC和8例HCC。患者年齡、性別及HBV DNA水平見表1。

表1 測序標本的一般情況

2.3 HBVEnh I/X基因啟動子的突變情況用GenBank中Genotyping對測序標本分析比對，發現所有標本均為B基因型。以標準株AF100309為參考序列，發現14個主要突變位點，其中調控區出現3個突變點：T960A、A987G、C1020T；核心區出現5個突變點：A1077C、A1080G、A1123T、C1135T和G1137A；X基因重疊區出現6個突變點：G1218C/A、A1221C、A1242C、A1317G、A1320C、G1347A。突變率較高的位點有A1077C，A1123T和G1218C/A在CHB、LC及HCC組中的突變率分別為：20%、64.29%和50%；10%、50%和37.5%；50%、42.9%和50%。對CHB、LC和HCC三組患者間進行比較時，發現HBV EnhI/X基因啟動子出現了不同程度的變異。位點A1077C在LC組和HCC組的變異率為64.29%和50%，顯著高于CHB組（20%，χ2=7.076，P=0.029）；位點A1123T在LC組和HCC組的變異率為50%和37.5%，顯著高于CHB組（10%，χ2=7.619，P=0.022）；位點A1317G在LC組和HCC組的變異率為35.71%和50%，顯著高于CHB組（5%，χ2=8.019，P=0.018），見表2。

3 討論

我國是乙肝高發區。60%的人群被HBV感染過，10%的人群為HBsAg陽性攜帶者[5]。HBV感染是導致慢性肝臟疾病發生甚至HCC的最主要因素。HBV基因組是雙鏈環狀DNA，分結構基因和調節基因。目前已確定的開放讀碼框有PreS/S、PreC/ C、Pol以及X[6，7]。HBV調節序列由四個啟動子（C、X、SPI、SPII）和兩個增強子（EnhI、EnhII）組成。HBV Enh-I/X基因啟動子位于955~1359之間，是HBV基因組中的順式作用元件，包括調控區、核心區以及X基因啟動子區[8]。位于S-ORP下游的Enh I，可調控基因表達，在轉錄和翻譯過程中起重要作用，可與某些特定的細胞因子相結合，增加HbsAg、HbcAg和HbxAg的表達。研究表明Enh I的缺失可引起轉錄水平的下降[9]。HBV Enh-I/X基因啟動子定位于P基因中，末端于X基因啟動子重疊，該段基因能與核內轉錄因子相結合，提高各啟動子的轉錄水平，上調前基因組RNA的表達進而增強病毒復制。HBV X蛋白可反式激活Enh I對全基因組或是亞基因組啟動子控制下的轉錄，Enh I又增強了反式激活的易感性[10]。EnhI/X基因啟動子在調節HBV復制和轉錄上發揮重要作用，其序列上某些位點的突變可引起增強子活性的改變，導致各啟動子活性的下調，病毒載量的降低，使病毒復制能力下降而發生免疫逃逸，導致病毒難以清除，引起HBV感染慢性化。X基因啟動子突變可增加HBxAg的表達，增加肝癌發生的機會[11]。

表2 CHB、LC和HCC患者間HBV Enh I/X基因啟動子變異發生頻數比較

本研究對125份標本進行擴增，最終獲得HBV Enh-I/X基因42份。其中慢性乙型肝炎(CHB)20例，肝硬化（LC）14例，肝細胞癌（HCC）8例。以AF100309為參考序列，發現14個主要突變位點，突變率較高的位點有A1077C，A1123T和G1218C/ A在CHB、LC及HCC組中的突變率分別為：20%、64.29%和50%；10%、50%和37.5%；50%、42.9%和50%。然而某些位點（如G1218C/A）的突變率雖然很高，在CHB、LC和HCC三組間并無統計學差異。對CHB、LC和HCC三組患者間進行比較時，發現HBV Enh-I/X基因啟動子出現了不同程度的變異。位點A1077C在LC組和HCC組的變異率為64.29%和50%，顯著高于CHB組（20%，χ2=7.076，P=0.029）。有報道稱肝細胞內的多種蛋白因子可與HBV EnhI核心區相互作用，調節HBV的復制和轉錄水平[12]。位于核心區的A1077C突變可能影響EnhI活性，降低病毒顆粒的分泌，造成病毒的免疫逃逸和持續性感染。位點A1123T在LC組和HCC組的變異率為50%和37.5%，顯著高于CHB組（10%，χ2=7.619，P=0.022）。nt1123位點的變異可能影響其與HNF3轉錄因子的結合，降低Enh I活性，抑制HBV的基因表達與復制，從而逃避宿主免疫系統對病毒的清除，造成乙肝慢性化[13，14]。核心區其他突變A1080G、C1135T和G1137A在三組間無統計學意義。位點A1317G在LC組和HCC組的變異率為35.71%和50%，顯著高于CHB組（5%，χ2= 8.019，P=0.018）。A1317G位于X基因重疊區，可以影響X啟動子的活性，引起肝內炎癥活動，加快疾病進程[15，16]。本研究變異位點與既往報道并不完全一致，可能因為不同地區所流行的基因型和亞型具有差異性，也可能與所選對象的肝炎癥狀、病毒載量等有關。有報道稱G1053A和G1229A的變異是肝硬化患者發生HCC的高危因素[3]，但在本研究中并未發現這兩個位點的突變，而本文發現位點A1077C在LC組和HCC組的變異率顯著高于CHB組，此前尚未有過報道，其與肝癌發生的相關性是否在本地普遍流行還需進一步研究。

HBV的突變可影響轉錄水平及復制水平，往往使感染后的病情進展趨于復雜。對HBV Enh I/X基因啟動子的突變及其與疾病進程的相關性進行研究，發現A1077C、A1123T和A1317G的位點突變或許可以作為CHB發展為肝硬化甚至肝細胞癌的預警信號，但仍需更大樣本和更深入的縱向研究來確定Enh I/X基因啟動子的突變在肝臟疾病進程中的作用。本研究的不足之處是未檢測出C基因型，不同基因型是否影響疾病發展尚需擴大樣本進一步研究。

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R512.6+2，R446.62

A

1674-1129(2016)06-0728-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2016.06.010

2016-07-25；

2016-11-23)

贛州市科技局指導性計劃課題，編號：GZ2015ZSF109

肖九長，1969年9月生，學士學位，副主任技師，研究方向為生物化學、腫瘤免疫及分子生物學。Email：18007079870@126. com

鄒淑慧，1988年11月生，碩士學位，檢驗技師，研究方向為病原生物學。E-mail：364235529@qq.com