鞘磷脂合酶抑制劑對血管緊張素Ⅱ誘導的高血壓小鼠心肌纖維化的影響

范一帆 齊 丹 劉佳馨 楊新春*

(1. 首都醫科大學附屬北京朝陽醫院心臟中心 高血壓病研究北京市重點實驗室，北京 100020；2. 北京市順義區醫院心內科， 北京 101300)

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· 心血管疾病的病理生理機制 ·

鞘磷脂合酶抑制劑對血管緊張素Ⅱ誘導的高血壓小鼠心肌纖維化的影響

范一帆1齊 丹1劉佳馨2楊新春1*

(1. 首都醫科大學附屬北京朝陽醫院心臟中心 高血壓病研究北京市重點實驗室，北京 100020；2. 北京市順義區醫院心內科， 北京 101300)

目的 研究鞘磷脂合酶抑制劑D609對血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)誘導的心肌纖維化的影響。方法 將雄性野生型C57BL/6J小鼠28只，采用隨機數字表區組分組法分為對照組、D609組、AngⅡ組和AngⅡ+D609組，每組7只。通過持續皮下灌注AngⅡ建立高血壓模型，2周后觀察小鼠的血壓變化，行心臟超聲評估心臟結構和功能。采用HE與Masson染色觀察心肌纖維化。使用ELISA方法測定小鼠血漿中炎性反應因子、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)及白細胞介素(interleukin-6，IL-6)的濃度。結果 與對照組小鼠比較，AngⅡ組小鼠血壓出現顯著升高和心肌肥厚，而且心肌纖維化明顯增加，血漿中TNF-α及IL-6的濃度顯著增加。與AngⅡ組比較，AngⅡ+D609組小鼠血壓降低，心肌肥厚明顯減輕，心肌及血管組織的膠原纖維沉積顯著減少，且血漿TNF-α及IL-6的濃度顯著降低。結論 鞘磷脂合酶在高血壓導致的心肌纖維化中可能發揮重要作用。

高血壓；心肌纖維化；鞘磷脂合酶

高血壓是臨床最常見、最重要的心血管疾病之一，心肌纖維化是高血壓導致心臟重塑的重要病理改變。心肌纖維化的發生機制非常復雜，研究[1-2]顯示，壓力負荷過重、炎性反應均與心肌纖維化的形成有關。研究[3]顯示，磷脂作為一種具有血管活性的脂質，磷脂的代謝可能在高血壓的發生發展過程中起到了重要的作用。鞘磷脂(sphingomyelin，SM)是構成細胞膜上脂筏結構的重要脂質之一，脂筏參與了許多信號轉導途徑的調控。鞘磷脂合酶(sphingomyelin synthase，SMS)是鞘磷脂合成的關鍵酶[4]。然而，SMS是否參與高血壓心肌纖維化過程尚不清楚。本文將建立血管緊張素 Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)誘導的小鼠高血壓心肌纖維化模型，探討SMS抑制劑D609對高血壓小鼠心肌纖維化及炎性反應因子的影響。

1 材料與方法

1.1 動物與主要試劑

C57BL/6J雄性小鼠28只，10～12周，體質量22～26 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物合格證號：SCXK(京)2012-0001。SPF級動物房飼養。Alzet微量滲透泵(Durect Corporation公司，美國)；小動物無創血壓儀(BP98A，Softron公司，日本)；D609(Tocris Bioscience公司，英國)；血管緊張素 Ⅱ (angiotensin Ⅱ，Sigma公司，美國)；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)及白介素6(interleukin-6，IL-6)Elisa試劑盒(R&D Biosystems公司，美國)；Masson染色劑(Sigma公司，美國)。

1.2 動物分組及造模

小鼠采用隨機數字表區組分組法隨機分為4組，每組7只。分組方法如下：小鼠標記編號后分別稱體質量并記錄，按體質量從小到大的順序排列，然后按體質量從小到大的順序將小鼠編號填寫到1至4組，下一輪按照順序填寫到4至1組，以此類推，按照“之”字形，將小鼠平均分配到各實驗組。實驗分組：對照組[0.9%(質量分數)氯化鈉注射液灌注]，D609組[0.9%(質量分數)氯化鈉注射液灌注，10 mg·kg-1·d-1D609腹腔注射]，AngⅡ組(1 000 ng·kg-1·min-1AngⅡ灌注)和AngⅡ+D609組(1 000 ng·kg-1·min-1AngⅡ灌注，10 mg·kg-1·d-1D609腹腔注射)。采用皮下埋植法進行微量滲透泵灌注，手術方法詳見參考文獻[5]。小鼠造模前與造模后隔日測血壓，2周后應用HP SonoS 5500超聲診斷儀進行心臟參數檢測。

1.3 心肌組織HE及Masson染色

造模2周后取心室標本在4%(質量分數)多聚甲醛中固定，進行脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋后制作石蠟切片。用HE染色法觀察心臟炎性細胞的分布，用Masson染色觀察膠原纖維的分布。

1.4 血漿炎性反應因子的檢測

分離小鼠血漿凍存，具體操作按Elisa試劑盒說明書進行。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 各組小鼠尾動脈收縮壓比較

4組小鼠基線血壓相比差異無統計學意義。造模2周后，與Sham組相比，AngⅡ組小鼠的收縮壓持續升高并維持在較高的血壓水平。而Ang Ⅱ+D609組小鼠的收縮壓顯著低于Ang Ⅱ組(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組小鼠收縮壓比較

Tab.1 Systolic blood pressure in four groups

*P<0.05vssham group，#P<0.05vsAngⅡ group，△1 mmHg=0.133 kPa.

2.2 各組小鼠超聲心動圖結果

二維超聲心動圖以左室長軸切面進行M型超聲掃描，并運用脈沖多普勒超聲從二尖瓣乳頭肌切面進行掃描分析。AngⅡ微量泵灌注組小鼠的舒張期左室前壁厚度(left ventricular diastolic anterior wall thickness，LVAWd)及收縮期左室前壁厚度(left ventricular systolic anterior wall thickness，LVAWs)與對照組相比均顯著增加(P<0.05)，AngⅡ+D609組小鼠的LVAWd、LVAWs測量值與AngⅡ組相比顯著降低(P<0.05)。其他測量指標組間差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見表2。

2.3 心肌組織病理觀察

HE染色顯示：Sham組小鼠心肌細胞體積較小，大小均一，飽滿，排列較整齊。Ang Ⅱ組小鼠心肌細胞體積變大，大小不均一，形態不規則，排列紊亂，細胞壁不完全清楚，細胞相交處可見融合。Masson染色顯示：心肌細胞核呈黑藍色，膠原纖維呈亮藍色，肌纖維、紅細胞呈紅色。光鏡下觀察，Ang Ⅱ組小鼠出現明顯的心肌間質纖維化、血管周圍纖維化。Ang Ⅱ+D609組小鼠心肌間質、血管周圍纖維化與Ang Ⅱ組相比顯著減輕(圖1)。

表2 各組小鼠超聲心動圖結果

Tab.2 Echocardiography results of four groups of mice

ItemShamD609AngⅡAngⅡ+D609PHR/min-1458．70±17．16458．50±34．93446．63±27．91447．17±28．370．102LVIDd/mm4．14±0．194．37±0．163．86±0．183．58±0．40．083LVIDs/mm2．88±0．363．53±0．452．71±0．072．48±0．460．066LVPWd/mm0．69±0．050．65±0．130．72±0．120．79±0．170．059LVPWs/mm0．90±0．080．85±0．21．01±0．160．99±0．120．695LVAWd/mm0．61±0．110．63±0．081．07±0．09?0．75±0．13?#<0．001LVAWs/mm0．80±0．230．76±0．231．28±0．16?0．91±0．14?#<0．001EF/%57．90±11．0758．98±15．7657．06±7．5064．4±13．160．852FS/%30．55±7．0429．22±8．8529．56±5．1235．19±9．150．522E/A1．68±0．361．8±0．541．48±0．071．37±0．140．326

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsAngⅡ group;AngⅡ: angiotensin Ⅱ; HR: heart rate; LVIDd: left ventricular diastolic internal dimension; LVIDs: left ventricular systolic internal dimension; LVPWd: left ventricular diastolic posterior wall thickness; LVPWs: left ventricular systolic posterior wall thickness; LVAWd: left ventricular diastolic anterior wall thickness; LVAWs: left ventricular systolic anterior wall thickness; EF: ejection fraction; FS: fractional shortening; E: early peak flow velocity; A: atrium peak flow velocity. Values were expressed as means ±SD.

圖1 心肌及血管組織Masson染色

Fig.1 Masson staining results of cardiac fibrosis(100×)

Light blue area showed interstitial and perivascular myocardial fibrosis. Sham group(A)and D609 group(B) showed normal myocardial cells in good order. AngⅡ group(C) and Ang Ⅱ+D609 group(D) showed disordered larger myocardial cells and increased cardiac fibrosis. Ang Ⅱ+D609 group(D) showed less cardiac fibrosis than AngⅡ group;AngⅡ: angiotensin Ⅱ.

2.4 小鼠血漿炎性反應因子的測定

ELISA檢測小鼠血漿中炎性反應因子，通過單因素方差分析，結果發現各組小鼠血漿中TNF-α及IL-6的濃度差異均有統計學意義(P<0.001)。Ang Ⅱ處理組小鼠血漿中TNF-α及IL-6的濃度顯著高于Sham組(P<0.05)(圖2，3)，而Ang Ⅱ+D609處理組小鼠血漿中TNF-α及IL-6的濃度與Ang Ⅱ組相比顯著降低(P<0.05)(圖2，3)。

3 討論

本研究著眼于鞘磷脂合酶抑制劑在高血壓發生發展中的作用，在Ang Ⅱ誘導的小鼠高血壓模型中觀察了鞘磷脂合酶抑制劑對血壓、心血管重塑、炎性反應的影響。結果發現鞘磷脂合酶抑制劑作用于Ang Ⅱ誘導的高血壓小鼠，能降低血壓，減輕高血壓所致的心室壁肥厚，減少心肌及血管組織膠原纖維的沉積，

圖2 4組小鼠血漿TNF-α濃度測定

Fig.2 Plasma level of TNF-α in four groups of mice

*P<0.05vssham group；#P<0.05vsAngⅡ group；TNF-α：tumor necrosis factor-α.

圖3 4組小鼠血漿IL-6濃度測定

Fig.2 Plasma level of IL-6 in four groups of mice

*P<0.05vssham group；#P<0.05vsAngⅡ group；IL-6：interleukin-6;AngⅡ: angiotensin Ⅱ.

并且對高血壓所致的炎性反應有抑制作用。目前有證據[6]顯示磷脂作為一種具有血管活性的脂質，對細胞的增生、凋亡有重要的調節作用。因此，磷脂代謝可能在高血壓的發生發展過程中起著重要的作用。鞘磷脂合成途徑中有多種代謝成分已經被證實與內皮細胞功能、血管的舒縮功能以及高血壓的形成有關。Fenger等[7]通過對高血壓患者的基因分析研究，證實磷脂類多種代謝成分的基因表達與高血壓的形成有密切聯系。Nogo-B抑制磷脂代謝途徑中的絲氨酸棕櫚酰轉移酶，研究[8]顯示Nogo-B敲除小鼠與野生型小鼠比較，不僅表現較低的基礎血壓，而且能降低AngⅡ誘導的高血壓，改善內皮功能，增加一氧化氮(nitric oxide， NO)釋放。1-磷酸鞘氨醇能調節動脈壁的彈性，并調節血管內皮細胞的通透性。在自發性高血壓小鼠體內的研究[9]顯示1-磷酸鞘氨醇的表達上調，1-磷酸鞘氨醇通過作用于表皮生長因子受體及血小板源性的生長因子，從而減輕炎性反應。鞘磷脂的合成原料神經酰胺則可通過上調血栓素A2的表達水平，進而調節內皮依賴性動脈收縮功能，導致血壓升高[10]。多中心大規模臨床試驗[11]顯示，血漿鞘磷脂濃度是心血管疾病的獨立預測因子，而且與體質量指數、收縮壓呈正相關。通過對高血壓患者進行24 h動態血壓監測，結果顯示非杓型高血壓患者的血漿鞘磷脂濃度顯著高于杓型高血壓患者[12]。本實驗結果發現抑制鞘磷脂合酶能顯著降低AngⅡ誘導的高血壓，提示鞘磷脂合酶可能參與高血壓的形成。

在心肌重塑的發展過程中， AngⅡ作為腎素-血管緊張素-醛固酮系統最重要的效應因子，可導致心肌功能障礙及炎性反應。研究[13]顯示AngⅡ的刺激能誘導轉化生長因子，血小板源性的生長因子以及內皮素-1的生成增加，促進心肌肥厚及纖維化進程，并導致左心室功能減低。抑制鞘磷脂合酶的表達使細胞中鞘磷脂的合成減少，進而導致細胞內及血液循環中SM的濃度減低[4]。研究[14]顯示巨噬細胞中SMS具有促炎活性，通過調節NF-κB和MAPK的活性，從而影響巨噬細胞增生和脂質代謝。鞘磷脂合酶基因敲除能減少動脈粥樣硬化斑塊的面積，增加斑塊內膠原的量，增強斑塊的穩定性，具有抗動脈粥樣硬化的作用。然而，鞘磷脂合酶對高血壓心肌纖維化的作用及其機制尚無相關報道。本研究結果顯示，AngⅡ組小鼠血漿中炎性反應因子增加，心肌細胞間質中膠原纖維大量沉積，因此，抑制鞘磷脂合酶能顯著減少心肌細胞間質中膠原纖維的合成，可能與抑制炎性反應有一定關系。大量研究[2,15]顯示，心肌纖維化的形成機制與炎性反應、氧化應激、心肌細胞凋亡等多種復雜因素相關。本研究初步證明鞘磷脂合酶參與AngⅡ誘導的高血壓心肌纖維化，其中具體的作用機制有待進一步研究。

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編輯 陳瑞芳

Effect of sphingomyelin synthase inhibitor on angiotensinⅡ-induced cardiac fibrosis in hypertensive mice

Fan Yifan1, Qi Dan1, Liu Jiaxin2, Yang Xinchun1*

(1.DepartmentofCardiology,BeijingChaoyangHospital,CapitalMedicalUniversity,BeijingKeyLaboratoryofHypertension,Beijing100020,China; 2.DepartmentofCardiology,TheHospitalofShunyiDistrict,Beijing101300,China)

Objective To study the role of sphingomyelin synthase inhibitor (D609) on angiotensin Ⅱ (AngⅡ)-induced cardiac fibrosis in hypertensive mice. Methods Totally 28 male C57BL/6J mice were randomly divided into 4 groups: Control group, D609 treatment group, AngⅡ-infusion group and AngⅡ+D609 treatment group. Two weeks later, blood pressure was measured and echocardiography was performed. Cardiac fibrosis was evaluated by HE and Masson staining. Plasma level of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-6 (IL-6) was measured by ELISA. Results Compared with control group, AngⅡ-infusion group showed increased blood pressure, myocardial hypertrophy, cardial fibrosis and decreased plasma level of TNF-α and IL-6. Compared with AngⅡ group, AngⅡ+D609 group demonstrated that D609 could significantly decrease the blood pressure, reduce myocardial hypertrophy and cardiac fibrosis, and also attenuate inflammatory responses by decreasing plasma level of TNF-α and IL-6. Conclusion Sphingomyelin synthase may play an important role in AngⅡ-induced cardiac fibrosis.

hypertension; myocardial fibrosis; sphingomyelin synthase

國家自然科學基金青年項目(81200194)，北京市自然科學基金面上項目(7122072)，中國博士后科學基金特別資助(2012T50115)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China (81200194), Natural Science Foundation of Beijing(7122072)，China Postdoctoral Science Foundation Funded Project (2012T50115).

時間：2016-12-14 20∶19

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20161214.2019.032.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2016.06.003]

R 544.1

2016-10-03)

*Corresponding author， E-mail：yxc6229@sina.com