旋轉蒸發結合GC-MS/MS測定白酒中氨基甲酸乙酯

馮向東，蔡開云，周　丹

(湖北稻花香酒業股份有限公司，湖北宜昌443100)

旋轉蒸發結合GC-MS/MS測定白酒中氨基甲酸乙酯

馮向東，蔡開云，周丹

(湖北稻花香酒業股份有限公司，湖北宜昌443100)

氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，EC），是發酵食物和酒精飲品在發酵或貯存過程中天然產生的一種致癌性污染物。以D5-氨基甲酸乙酯為內標，采用旋轉蒸發結合GC-MS/MS法分析測定白酒中EC含量，完善優化實驗條件，經實驗分析得到最佳旋轉蒸發溫度為40℃。此條件下，旋轉蒸發時間約為15min，標準工作曲線相關系數R2=0.99996,檢出限為0.6μg/L，加標回收率在97.5%～100.5%之間，相對標準偏差RSD均＜5%，能夠滿足白酒中EC檢測分析需要。

白酒； 氨基甲酸乙酯； 旋轉蒸發；gC-MS/MS

氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，EC）是發酵食物和酒精飲品在發酵或貯存過程中天然產生的污染物[1-2]。不同種類的酒精飲品的EC含量差異很大，例如水果白蘭地中EC含量平均值是啤酒的600倍以上。酒精飲品中的各種物質及其分解物經發酵過程后均可產生EC。這些前體物質（如尿素、氰酸酯和瓜氨酸）與乙醇發生化學作用，在酒精飲品中產生EC，而產生的數量取決于光線和溫度兩大要素[3]。

食物內的EC可能令人類患癌，因而引起公眾的關注。實驗顯示，EC可令實驗動物患上各類癌癥。2007年，國際癌癥研究機構把EC重新分類為第2A組（“可能令人類患癌的物質”）[4-5]。EC潛在的致癌性促使許多國家和機構制定了其在發酵食品和酒精飲料中的限量標準，加拿大的衛生與預防部門規定，蒸餾酒中EC含量不得超過150μg/L[6]。

目前國內針對EC的測定均采用GB 5009.223— 2014《食品中氨基甲酸乙酯的測定》標準。但檢測過程中發現以下幾個問題：①樣品前處理過程大量使用易揮發性有毒有害化學試劑，給環境和人體帶來污染和危害，尤其是正己烷和乙醚；②樣品在使用氮氣吹干的過程中，乙醚揮發出來，乙醚的蒸汽與空氣可形成爆炸性混合物，遇明火、熱極易爆炸燃燒，給實驗室和測試人員帶來安全隱患；③樣品前處理耗時長，效率不高；④檢測結果的重現性差。

郭學武等[7-8]在《GC-MS測定白酒中氨基甲酸乙酯不同預處理方法的比較》中總結了前人改進后的3種樣品預處理方法分別是：固相萃取（SPE）、固相微萃取（SPE）、雙水相萃取（LLE）。雖然相對于國標方法有所改進，但操作過程依舊繁瑣、成本高、有機溶劑用量大。本實驗采用旋轉蒸發結合GC-MS/MS法，以D5-氨基甲酸乙酯為內標，建立快速、準確檢測白酒中EC的方法，避免正己烷和乙醚等有毒有害試劑在測試中的使用，同時縮短樣品前處理時間，提高檢測效率。

1　材料與方法

1.1材料、試劑及儀器

酒樣：市售某白酒樣品。

儀器：Agilent7890A-7000B三重四級桿串聯氣質聯用儀，美國安捷倫公司；RE－52AA旋轉蒸發儀，上海賢德實驗儀器有限公司；無水硫酸鈉小柱（2g,6m L）,ANPEL Laboratory Technology公司。

試劑：EC標準品溶液（CAS:51-79-6,濃度100μg/m L，純度99.50%），ChemService公司；D5-氨基甲酸乙酯標準品（純度＞98%）,德國Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇，色譜純。

1.2實驗方法

1.2.1儀器條件

色譜條件：色譜柱：ZB-WAXplus石英毛細管柱（30m×0.25mm×0.25μm）；進樣口溫度：250℃；程序升溫：初始柱溫80℃，保持0m in,以10℃/m in升至180℃，保持0min,再以50℃/m in升至250℃，保持5m in；載氣：氦氣（純度＞99.999%）,流速1m L/m in；進樣方式：不分流進樣；進樣量：1μL。

質譜條件：接口溫度280℃，電離方式：電子轟擊源（EI）；監測方式：MRM；EC、D5-EC定量離子分別為m/z：62和m/z：64；電離能量：70 eV；溶劑延時：5m in。

1.2.2標準溶液的配制

（1）EC標準溶液：100μg/m L的EC標準品溶液。

（2）D5-EC標準溶液。儲備液：取0.1g D5-EC標準品用甲醇定容至100m L的容量瓶中，配制成1mg/m L的儲備液，于4℃冰箱中保存備用。

（3）標準溶液：取1m L D5-EC儲備液用甲醇定容至100m L，即為10mg/L的D5-EC內標使用液。

1.2.3標準曲線的繪制

標準曲線工作溶液的配制：用移液槍分別準確吸取100μg/m L EC標準溶液0μL、10μL、20μL、30μL、50μL、100μL于6個25m L的容量瓶中，各加入10mg/L的D5-EC內標使用液250μL，用甲醇定容至刻度。得到0、40μg/L、80μg/L、120μg/L、200μg/L、400μg/L的標準曲線工作溶液，每個容量瓶中內標物D5-EC的濃度均為100μg/L，現配現用。

標準曲線的繪制：將各個濃度的標準曲線工作溶液依次進行GC-MS/MS分析，對EC-D5EC峰面積比值和EC-D5EC濃度比繪制標準曲線并得出其回歸方程和相關系數。

1.2.4樣品的處理與測定

準確稱取5g（精確至0.01g）白酒樣品，加入50μL 10mg/L D5-EC內標使用液，搖勻后在旋轉蒸發儀上以一定溫度濃縮至近干（約0.5m L），加甲醇2m L搖勻后過無水硫酸鈉小柱，收集濾液，供GC-MS/MS分析。

2　結果與討論

2.1線性關系及檢出限

按1.2.2的方法繪制出的標準曲線見圖1，其中ECD5EC峰面積比值為Y軸，EC-D5EC濃度比為X軸。

圖1　標準工作曲線

由圖1可知，其回歸方程為Y=1.300943X，相關系數R2=0.99996，可見該標準曲線的線性關系較好，滿足分析的要求。按信噪比S/N＝3推算，檢出限為0.6μg/L。

2.2樣品處理條件的優化及回收率

在1.2.4樣品的處理中的關鍵點在旋轉蒸發儀的溫度控制，需要設置合適的蒸發溫度以使白酒中干擾EC測定的物質去除，并且溫度不能過高，以防止白酒樣品中氨基甲酸乙酯揮發而造成測試結果不準確。

2.2.1不同蒸發溫度下測試結果及加標回收率實驗

酒樣Y和加入一定EC標準溶液提高EC濃度后的酒樣Y，分別經40℃、50℃、60℃、70℃、80℃旋轉蒸發處理，經GC-MS/MS分析，測定結果對比見表1。

表1　不同蒸發溫度下酒樣Y的EC測試結果及加標后回收率

由表1可知，在40～80℃的5個梯度溫度下，樣品Y（未加標準物質）的EC測試結果在89.9～93.7μg/L之間，計算得RSD值為1.58%＜5%。可見在樣品低濃度時（約＜100μg/L），旋轉蒸發的溫度變化對樣品測試的結果基本無影響。

表2　40℃蒸發溫度下酒樣Y不同濃度的加標回收率實驗

樣品Y在加入一定量的標準物質后，使其理論濃度提高120μg/L（＞200μg/L），再分別經過40～80℃的5個梯度溫度旋轉蒸發，經GC-MS/MS分析測試。結果顯示，加標回收率在40℃較好，為95.6%；50℃回收率較低，僅為74.5%；隨著溫度升高，加標回收率降低，80℃僅為67.8%。由此得出，樣品高濃度條件（＞200μg/L）時，旋轉蒸發的溫度對測試結果準確度影響較大，分析原因可能是EC沸點為182～184℃，隨著溫度升高，樣品中一部分EC揮發出去，造成測試結果偏低。

由上述實驗初步得出，最佳的旋轉蒸發溫度應設置為40℃，此時樣品EC測試的準確度較好。

2.2.240℃下不同濃度加標回收率實驗

酒樣Y加入一定梯度EC標準溶液提高EC濃度后，分別經40℃旋轉蒸發處理，經GC-MS/MS分析，測定結果對比見表2。

由表2可知，在40℃旋轉蒸發溫度下，酒樣Y不同濃度的加標回收率在97.5%～100.5%之間，計算得RSD值為1.35%。回收率很好，能滿足不同濃度的樣品EC測試要求。所以選定該方案的關鍵條件旋轉蒸發溫度為40℃，此時旋轉蒸發時間約為15m in。

2.3精密度

取2種白酒樣品按照上述方法進行樣品處理（旋轉蒸發溫度40℃）和分析檢測，每個樣品做6次平行試驗，計算該方法的精密度，結果見表3。

表3　測試方法的精密度　(μg/L)

由表3可知，實驗中測試2種酒樣EC含量的RSD值分別為1.0%和2.4%（＜5%,差異極不顯著）。說明分析方法具有良好的重現性，可以滿足白酒中EC的檢測分析。

3　結論

以D5-氨基甲酸乙酯為內標，采用旋轉蒸發結合GC-MS/MS法分析測定白酒中EC含量，經實驗分析得到最佳旋轉蒸發溫度為40℃，此條件下，旋轉蒸發時間約為15m in，加標回收率在97.5%～100.5%之間。2種酒樣EC精密度實驗RSD均＜5%，具有較好的重現性，能夠滿足白酒中EC檢測的分析需要。

該方法對白酒蒸餾技術改進及自動化生產也提供了一種新思路。如果白酒中EC含量偏高，有給人體健康帶來危害的風險，則可以采取控壓、控溫蒸餾的辦法，使低沸點的乙醇等香味物質餾出，讓高沸點的EC殘留在原液中達到降低蒸餾酒中EC含量的目的，減少對人體健康危害的風險。

[1]高年發,寶菊花.氨基甲酸乙酯的研究進展[J].中國釀造,2006 (9)：1-4.

[2] 張莊英.白酒蒸餾和貯存過程中氨基甲酸乙酯的研究[D].無錫：江南大學,2014.

[3]Wu P,CaiC,Shen X,etal.Formation of ethylcarbamate and changesduring fermentation and storageof yellow ricew ine[J]. Food Chemistry,2014,152(6)：108-112.

[4]Baan R,Straif K,Grosse Y,etal.Carcinogenicity of alcoholic beverages[J].LancetOncology,2007,8(4)：292-293.

[5]Ronco A L,Acostag,Ferrog.The effectof smoking and drinking in oraland pharyngeal cancers:a case-controlstudy in Uruguay[J].Cancer Letters,2007,246：282-289.

[6]李安軍,劉國英,湯有宏,等.SPE結合GC-MS法測定白酒中的氨基甲酸乙酯[J].釀酒科技,2014(12)：99-101.

[7]郭學武,李園子,黃世永,等.GC-MS測定白酒中氨基甲酸乙酯不同預處理方法的比較[J].現代食品科技,2016(32)：1-4.

[8]史斌斌,徐巖,范文來.頂空固相微萃取(HS-SPME)和氣相色譜-質譜(GC-MS)聯用定量蒸餾酒中氨基甲酸乙酯[J].食品工業科技,2012,33(14)：60-63.

Detection of EC Content in Baijiu by Rotary Evaporation Coup led w ithgC-MS/MS

FENG Xiangdong,CAIKaiyun and ZHOU Dan
(Daohuaxiang Distillery Co.Ltd.,Yichang,Hubei443100,China)

EC is a kind of carcinogenic pollutants produced naturally in the fermentation/storage process of fermented food/alcoholic beverages.In this study,D5-EC used as the internal standard,rotary evaporation coupled w ithgC-MS/MSwasadopted formeasuring EC content in Baijiu.The optimum detection conditionswere summed up as follows:rotary evaporation temperaturewas at40℃,evaporation timewas 15 m in,R2=0.99996,the detection lim itwas 0.6μg/L,the recovery ratewasw ithin 97.5%～100.5%,and RSD＜5%.Suchmethod was suitable for the detection of EC content in Baijiu.(Trans.By YUEYang)

Baijiu;ethyl carbamate(EC);rotary evaporation;GC-MS/MS

TS262.3；TS261.4；TS261.7

A

1001-9286(2016)11-0120-03

10.13746/j.njkj.2016201

2016-06-15

馮向東(1972-)，男，高級質量工程師，一級食品檢驗師，一級品酒師。

優先數字出版時間：2016-08-03；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160803.1025.004.htm l。