濃香型白酒窖泥可培養好氧細菌群落結構分析

何培新，李芳莉，胡曉龍，李學思，鄭　燕

（1.鄭州輕工業學院食品與生物工程學院，河南鄭州450001；2.河南省宋河酒業股份有限公司，河南鹿邑477265）

濃香型白酒窖泥可培養好氧細菌群落結構分析

何培新1，李芳莉1，胡曉龍1，李學思2，鄭燕1

（1.鄭州輕工業學院食品與生物工程學院，河南鄭州450001；2.河南省宋河酒業股份有限公司，河南鹿邑477265）

采用稀釋涂布法分離了濃香型白酒窖池窖泥中的好氧細菌，并利用形態學特征結合16S rRNA基因序列分析技術對分離的細菌進行鑒定，探討窖泥可培養好氧細菌的群落結構。結果表明，根據菌落和細胞形態特征，分離到了1株無芽孢短桿菌和18株芽孢桿菌，均為革蘭氏陽性；采用16S rRNA基因序列分析，將19株細菌鑒定為9個種：米氏解硫胺素芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、菠茨坦短芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、側孢短芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、Paenibacilluslautus、耐寒短桿菌和P.cellulositrophicus；其中波茨坦短芽孢桿菌、米氏解硫胺素芽孢桿菌和P.lautus鮮有濃香型白酒窖泥中分布的報道。本研究揭示了濃香型白酒窖泥可培養好氧細菌的群落結構，為改善窖泥質量、提高白酒品質等提供了理論依據。

濃香型白酒； 窖泥； 好氧細菌； 16S rRNA基因

濃香型白酒以固態窖池發酵為特征，窖池中的窖泥為發酵微生物的生長繁殖提供了良好環境[1-2]。窖泥微生物群落對白酒的品質及特征香型的形成具有重要的影響。參與形成白酒香味成分的細菌主要有己酸菌、乳酸菌、甲烷菌和硫酸鹽還原菌等，以芽孢桿菌為主[3-5]。由于研究技術手段的限制，采用傳統的形態學和生理生化特征鑒定分離到的窖泥細菌，不僅費時費力，還難得到準確的結果[6-8]。隨著分子生物學技術的發展，傳統形態學特征結合16S rRNA基因序列分析技術顯著促進了微生物的分類與鑒定[9]，并廣泛應用于窖泥微生物的相關研究[1，10-11]。本研究以河南省宋河酒業10年窖齡窖池的窖泥為研究對象，采用傳統的微生物分離培養技術分離其中的好氧細菌，并通過形態學特征結合16S rRNA基因序列分析技術，對分離到的菌株進行鑒定，初步分析濃香型白酒窖泥中可培養細菌的群落結構，對改善窖泥質量、提高白酒品質等具有一定的理論意義。

1　材料與方法

1.1窖泥樣品采集

以5點取樣法采集河南省宋河酒業股份有限公司10年窖齡的窖池窖泥樣品，混勻后迅速密封，置于冰上運輸至實驗室，4℃保存備用。

1.2窖泥細菌分離培養與初步鑒定

稱取10g窖泥樣品，加入到裝有90m L無菌水的錐形瓶中，25℃、120 r/m in振蕩30m in，然后放到潔凈工作臺靜置30m in。在超凈工作臺中，用無菌注射器將過濾除菌的制霉菌素加入到融化并冷卻至50℃的牛肉膏蛋白胨培養基（牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、瓊脂20g，蒸餾水1000m L，pH 7.4～7.6）中，搖勻后制作平板。窖泥樣品10倍系列稀釋到105倍，取各稀釋度的樣品懸浮液0.2m L涂布在牛肉膏蛋白胨含藥平板上，每個稀釋度涂3個樣，37℃恒溫倒置培養48 h。計數細菌菌落數在30～300個的稀釋度平板，取平均數計算得細菌總數和各種細菌的含量。對各種不同特征的菌落進行劃線純化，得到多個細菌菌株。采用普通光學顯微鏡觀察各菌株的菌體形態，并進行革蘭氏染色試驗[12-14]。

1.3細菌基因組DNA提取

采用Ezup柱式細菌基因組DNA提取試劑盒（上海生工）提取細菌的基因組DNA。

1.416S rRNA基因擴增

利用16S rRNA基因通用引物515F-GTGCCAGCMGCCGCGG和907R-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT進行PCR擴增[15]。PCR擴增體系如下：1μL引物515F（10μM），1μL引物907R（10μM），0.15μL taq酶（5 U/μL），2.5μL 10×buffer，4μL dNTP(各2.5mM)，1μLDNA模板，加無菌水補足至25μL。PCR擴增反應條件如下：94℃預變性5.0 min；94℃變性45 s，55℃復性45 s，72℃延伸1.0m in，30個循環；最后72℃充分延伸10m in。利用1%瓊脂糖電泳檢測擴增產物。

1.5克隆、測序及序列分析

利用SanPrep柱式PCR產物純化試劑盒（上海生工）回收目的片段（約450 bp），利用pGEM-T載體試劑盒（北京全式金）克隆目的片段，利用M 13F/M 13R引物篩選出含有目的片段的克隆，送公司測序（上海生工）。

將測得的序列在NCBI數據庫中進行BLAST比對分析，選擇相關同源序列與分離菌株序列利用Mega 6.0軟件進行系統發育分析[15]。

2　結果與分析

2.1菌株分離與初步鑒定

結果表明，窖泥中的細菌總數為3.2×104cfu/g窖泥。根據菌落形態，共分離到19株代表性菌株（編號O2.1—O2.19）。各分離菌株的含量見表1。鏡檢觀察發現，除O2.18為無芽孢的短桿菌以外，其他18株細菌均為產芽孢桿狀細菌；革蘭氏染色結果均為陽性。

2.2分離細菌的16S rRNA基因擴增

細菌基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測可見明顯的DNA條帶，無明顯拖帶現象，完整性較好（圖1）。

圖1　分離細菌DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖譜

利用16S rRNA基因通用引物515F/907R進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測表明擴增產物長度約450 bp，與預期片段長度一致（圖2）；陰性對照泳道無電泳條帶（圖2b），表明擴增體系未受污染。電泳結果顯示，PCR擴增產物可以用于后續克隆、測序等分子生物學操作。

圖2　PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳分析

2.3系統發育分析

在BLAST比對分析的基礎上，對19株窖泥細菌的16S rRNA基因序列進行系統發育分析。結果表明，除O2.18以外，窖泥中分離出來的其他細菌都是芽孢桿菌，與形態學鑒定結果一致。在屬分類水平上，O2.4、O2.10、O2.15屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）；O2.9和O2.11屬于短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）；O2.17和O2.19屬于類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）；O2.1屬于解硫胺素芽孢桿菌屬（Aneurinibacillus）；O2.18屬于短桿菌屬（Brevibacterium）（圖3）。在種水平上，O2.1為米氏解硫胺素芽孢桿菌（A. migulanus），O2.4為枯草芽孢桿菌（Ba.subtilis），O2.9為菠茨坦短芽孢桿菌（Br.borstelensis），O2.10為地衣芽孢桿菌（Ba.licheniformis），O2.11為側孢短芽孢桿菌（Br. laterosporus），O2.15為短小芽孢桿菌（Ba.pumilus），O2.17為P.lautus，O2.18為耐寒短桿菌（Brevibacteriumfrigoritolerans），O2.19為P.cellulositrophicus（圖3）。分離菌株與基因庫相關菌株的16S rRNA基因序列的相似度均超過99%（表1）。

19株分離細菌的含量見表1。從表1可以看出，除O2.18不產芽孢（屬于短桿菌屬）以外，其他分離菌株均為產芽孢的桿狀細菌，其中以米氏解硫胺素芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的含量相對較高，分別占可培養細菌總數的26.3%和21.2%。

3　討論

本研究表明，采用16S rRNA基因序列分析的方法鑒定濃香型白酒窖泥中的細菌種類，與形態學鑒定結果一致，能夠快速地把分離到的細菌鑒定到屬或種的水平，實用性較強。該技術應用于濃香型白酒窖泥微生物鑒定的研究報道較多。趙輝等[1]采用微生物生理生化特征結合16S rRNA基因序列分析鑒定了濃香型白酒窖泥中高產己酸兼性厭氧細菌；葉光斌等[18]通過細菌和古菌的16S rRNA基因的系統發育分析，確定了濃香型白酒成熟窖泥中細菌和古菌的群落組成；鄭琦等[4]采用16S rRNA基因序列分析鑒定了瀘州老窖300年窖池窖泥中的微生物群系，將23株產芽孢細菌鑒定為3種芽孢桿菌屬的種類。

表1　分離細菌的BLAST比對同源性及在窖泥中的含量

圖3　窖泥分離細菌的16S rRNA基因序列系統發育分析

本研究分離到的濃香型白酒窖泥中的好氧細菌大多為產芽孢的細菌，其中米氏解硫胺素芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的含量較高，分別占可培養細菌總數量26.3%和21.2%，與游劍等[19]的研究結果一致；而分離到的波茨坦短芽孢桿菌、米氏解硫胺素芽孢桿菌和P.lautus等在以往的報到中鮮有出現。芽孢細菌成為濃香型白酒窖泥中的優勢微生物群系，可能與窖泥的高酒精度和低含氧量有關。相對于其他非芽孢細菌，產芽孢的細菌能在這種相對惡劣的環境條件下大量生長繁殖，從而逐漸占優勢地位[2，11，20-22]。此外，在濃香型白酒生產過程中，芽孢細菌能水解淀粉、蛋白質等大分子物質，并利用糟醅浸潤到窖泥中的營養物質產生丁酸和己酸等有機酸，是重要的產酸和產香菌[2，20]。吳文睿等[23]以古井貢酒（濃香型白酒）的窖泥樣品為研究對象，研究不同芽孢桿菌對白酒風味成分的影響。結果表明，枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌的發酵液中含有大量3-羥基-2-丁酮和2, 3-丁二醇；3-羥基-2-丁酮具有特有的奶油香味，是酒液中的一種重要芳香成分，可用于合成2,3,5,6-四甲基吡嗪，賦予酒濃厚的風味；2,3-丁二醇是白酒中重要的多元醇之一，是主要甜味芳香物質，能使酒醇厚綿甜，有自然感；短小芽孢桿菌產己酸乙酯量、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚的量較大，其在濃香型白酒的風味和口感方面起著重要作用。這些研究結果表明，芽孢桿菌的含量通常作為濃香型白酒窖泥質量評價的重要指標之一，其功能特性影響白酒品質，特別是對白酒生香更為重要，在白酒發酵中發揮著重要作用。

濃香型白酒是我國市場上主要的白酒類型，銷量占中國白酒市場份額的70%左右。窖池作為濃香型白酒的發酵容器，其中的窖泥在濃香型白酒生產中扮演了比較重要的角色。本研究以濃香型白酒生產廠家宋河酒業的10年窖齡窖池的窖泥為研究對象，采用傳統的稀釋涂布法分離窖泥中的好氧細菌，并采用形態特征結合16S rRNA基因序列分析技術對菌株進行鑒定。研究結果表明，分離得到的19株細菌主要為產芽孢的細菌，分別屬于9個不同的種，其中分離到的波茨坦短芽孢桿菌、米氏解硫胺素芽孢桿菌和P.lautus等在以往的報到中鮮有出現。本研究為揭示窖泥中可培養好氧細菌的群落結構，充分發揮有益微生物正常代謝活動，強化白酒中主體風味物質，提高酒類品質等提供科學依據。

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Analysisof the Community Structureof Aerobic Bacteria in PitM ud of Nongxiang Baijiu

HEPeixin1,LIFangli1,HU Xiaolong1,LIXuesi2and ZHENGYan1
(1.Schoolof Food and Bioengineering,Zhengzhou University of Light Industry,Zhengzhou,He'nan 450001; 2.Songhe Distillery Co.Ltd.,Luyi,He'nan 477265,China)

s:In the experiment,aerobic bacteria in pitmud of Nongxiang Baijiu were isolated by dilution platingmethod,and then identified by morphological characteristics coupled w ith sequence analysis of 16S rRNAgene.The results indicated that,one strain of non spore-producing short rod-shaped bacterium and 18 strains of spore producinggram-positive bacteriawere isolated,and those 19 strainswere identified as 9 species by 16S rRNAgene sequencing analysis,including Aneurinibacillusmigulanus,Bacillus subtilis,Brevibacillus borstelensis,Ba.licheniformis,Br.laterosporus,Ba.pumilus,Paenibacillus lautus,Brevibacterium frigoritolerans and P.cellulositrophicus.Among them,the distribution of Br.Borstelensis,A.migulanus and P.Lautus in pitmud of Nongxiang Baijiu were seldom reported.This study revealed the community structure of aerobic bacteria in pitmud of Nongxiang Baijiu,and provided theoreticalevidence for improving pitmud quality and improving liquorquality.

Nongxiang Baijiu;pitmud;aerobic bacteria;16S rRNAgene

TS262.3；TS261.1；TS261.4

A

1001-9286（2016）11-0065-04

10.13746/j.njkj.2016262

2016-08-29

何培新（1970-），博士，教授，主要從事發酵工程研究。

鄭燕（1986-），博士，主要從事釀造酒工程研究。

優先數字出版時間：2016-10-12；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20161012.1519.019.htm l。