陶香型窖池中1株高產乙酸乙酯酵母的篩選與鑒定

侯建光，郭富祥，樊建輝，韓素娜，張俊峰，陳蒙恩

（河南仰韶酒業有限公司博士后研發基地，河南澠池472400）

陶香型窖池中1株高產乙酸乙酯酵母的篩選與鑒定

侯建光，郭富祥，樊建輝，韓素娜，張俊峰，陳蒙恩

（河南仰韶酒業有限公司博士后研發基地，河南澠池472400）

從仰韶陶香型窖池糟醅中篩選產香功能微生物，研究其與大曲酒香味物質之間的聯系，并對產香功能菌進行分子生物學鑒定。采用傳統微生物分離方法，從不同發酵階段的陶香型窖池糟醅中分離獲得25株酵母菌。以豆芽汁培養基為底物，對各酵母菌株進行單菌產香實驗，經聞香評定，菌株YS/Y/22能夠產生濃郁的酒香味和水果香味。采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術對該菌株的發酵產物進行揮發性成分檢測分析，發現菌株YS/Y/22發酵產物的主要香味成分為乙酸乙酯，是大曲酒的重要香味成分之一，因此可確定菌種YS/Y/22為陶香型窖池糟醅中的1株產香功能菌。經形態學觀察和分子生物學鑒定，確定菌株YS/Y/22為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomycesanomalus）。

陶香型窖池； 產香微生物； 揮發性成分； 篩選； 鑒定

陶香型是豫酒的獨有香型，屬于今年來中國白酒行業的創新性香型，目前不少專家、學者對濃香、清香、醬香、芝麻香等香型的成因及發酵過程中產香微生物等進行了廣泛深入的研究，但對陶香型白酒產香功能微生物的研究卻未見報道。仰韶陶香型白酒是指在仰韶地域自然環境、生產原料、釀造工藝等因素的前提下，生產的兼有濃香型、清香型、醬香型、芝麻香型4種香型的白酒，其以幽雅的醬香和濃香的窖香為主體香韻，細膩的芝麻香和凈柔的清香為載體，滿足了廣大消費者全方位飲酒舒適度的需求[1-3]。

本研究以仰韶地區不同發酵階段的陶香型工藝窖池為研究對象，對其發酵各階段糟醅中的產香微生物進行篩選，分析鑒定其揮發性代謝產物，探尋與陶香型白酒香味成分之間的關系，以期找到產香性能突出的菌株，改良窖池發酵功能菌群，為提高陶香型白酒的產質量和改善原酒風味奠定基礎，為推動中國白酒地域資源的有效利用和地域資源型白酒企業健康發展提供支撐。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1酒糟樣品

選取河南仰韶酒業有限公司陶香型窖池10口，從其酒糟入池后1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、15 d、20 d、30 d的酒糟，采取五點取樣法，將窖池酒糟分上、中、下3層進行取樣，混勻，并分別用無菌袋保存至4℃冰箱備用。

1.1.2培養基

分離培養基：WL培養基；種子液培養基：葡萄糖20g，胰蛋白胨20g，酵母浸出膏10g，蒸餾水1000 m L，pH5.0～5.5；發酵培養基：葡萄糖含量50g，豆芽汁200g，酵母粉5g，蒸餾水800m L。

1.1.3試劑

TaqDNA polymerase，dNTPs，DL2000TMDNAMarker，均購自西安熱默爾生物科技；溶菌酶，蛋白酶K，酵母基因組DNA快速抽提試劑盒，均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.4儀器與設備

SF-CT-1A型超凈工作臺：上海三發科學儀器有限公司；B203LED型生物顯微鏡，重慶奧特光學儀器有限公司；KF960型PCR儀，杭州晶格科學儀器有限公司；50μm/30μm DVAB/CAR/PDMS固相微萃取頭，美國Supelco公司；DYY-6C型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；WD-9403C型紫外儀，北京六一生物科技有限公司；HYG-B型搖床，蘇州培英實驗設備有限公司；20m L帶硅橡膠墊的樣品瓶，美國Supelco公司；D-37520型離心機，德國SIGMA公司；Thermo Scientific Trace1310-ISQ氣相色譜-質譜聯用儀，美國賽默飛世爾而科技公司；DHP-9272電熱恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；HH-型數顯恒溫水浴鍋，常州普天儀器制造有限公司；LDZM-80KCS-Ⅱ型立式壓力滅菌器，上海申安醫療器械廠。

1.2實驗方法

1.2.1酵母菌的分離與純化

采用稀釋平板涂布法對微生物進行分離培養。準確稱取1g酒糟樣品，置于裝有99m L無菌水的三角瓶中，振蕩30min。然后用移液槍吸取100μL振蕩均勻的菌懸液，置于裝有900μL無菌水的1.5m L離心管中，振蕩均勻，以此10倍逐級稀釋至10-7。取10-5、10-6、10-73個稀釋度的菌懸液100μL于WL培養基上進行平板涂布，之后于28℃倒置培養48 h。待長出適宜大小菌落后，選取具有典型酵母菌特征的菌落進行分離純化、鏡檢編號，接種于斜面試管中保藏。

1.2.2產香實驗

分離的各酵母菌株分別接入對應編號的種子培養基中，于28℃培養48 h后，調節種子液濃度至107個/m L。之后按10%接種量接種于滅菌處理后的豆芽汁液體培養基中，以2℃培養7 d，然后對發酵產物進行聞香評定、揮發性成分鑒定。

1.2.3揮發性成分檢測[4-5]

頂空固相微萃取條件：取8m L（10%）發酵液倒入20m L頂空瓶（專用）中，5μL內標（乙酸正戊酯和2-乙基丁酸），旋緊瓶蓋，60℃孵化萃取45m in后取出萃取頭，插入GC進樣口熱解吸5m in，熱解吸溫度250℃。

氣相色譜條件：毛細管色譜柱為DB-FFAP（60m× 0.25μm，0.25μm），進樣口和檢測口溫度均為250℃，載氣為He，流速為2m L/m in。程序升溫：初始溫度為50℃，穩定2m in后，以4℃/m in升至230℃，保持15m in。

質譜條件：EI電離源，掃描范圍20～550 u，電子能量70 eV，離子源溫度230℃，接口溫度230℃。

1.2.4產香功能菌株鑒定[6-7]

對篩選出的產香性能突出的菌株采用顯微鏡進行形態觀察，并進行分子生物學鑒定。采用18S rDNA分子生物學對產香性能突出的酵母菌株進行鑒定，引物設計為NL-1：GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG和NL-4：GGTCCGTGTTTCAAGACGG。利用PCR擴增技術對18S rDNA進行擴增后送樣測序，將測序結果在國際GeneBank中進行BLAST比對，利用MEGA5.05軟件進行多重序列同源性比對分析，并采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod）構建系統發育樹。

2　結果與分析

2.1微生物篩選、純化結果

采用稀釋平板涂布法對不同發酵階段陶香型酒糟樣品中的酵母進行分離，選取具有典型酵母菌特征的菌落進行純化，結合顯微鏡下的細胞形態，得到酵母25株，分別編號為YS/Y/1—YS/Y/25。

2.2液體發酵產香結果

2.2.1液態發酵產物感官評價結果

將分離獲得25株酵母的種子液接種至豆芽汁液體培養基中培養，然后對各菌株發酵產物進行外觀、氣味評價，其中6株酵母發酵后香氣較好，其發酵7 d后的液態產物感官評價結果見表1。

表1　各菌株液態發酵產物感官評價

由表1可知，各菌株發酵豆芽汁液體培養基后所產生的感官特征各異。酵母菌株YS/Y/7、YS/Y/8、YS/Y/ 11、YS/Y/20、YS/Y/22、YS/Y/25發酵后產物有令人愉悅的香味，可初步確定為具有產香性能的菌株。其中菌株YS/Y/22經過28℃發酵7 d后，發酵基質呈深黃色，菌體生長旺盛，發酵液內有白色呈現，且帶有濃郁的酒香味和水果香味。其他菌株發酵后均未產生令人愉悅的香味，或保持豆芽汁培養基原味，或無味或產生怪味。綜合來看，菌株YS/Y/22的產香性能較為突出，可作為下一步揮發性發酵產物研究的菌株。

圖1　菌株YS/Y/22發酵產物揮發性物質GC-MS總離子流色譜圖

2.2.2液態發酵產物揮發性成分測定結果

對菌株YS/Y/22發酵7 d后的液態產物采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術測定其中的揮發性物質，其萃取的揮發性物質的總離子流色譜圖見圖1，分析鑒定出的揮發性物質見表2。

表2　菌株YS/Y/22發酵產物揮發性物質測定

對菌株YS/Y/22的發酵產物跟蹤進行感官和揮發性成分分析，結果表明，隨著發酵時間的延長，發酵基質由原來的豆芽汁原味、無香味，演變為濃郁的酒香味和水果香味。剛開始發酵原料中并無乙酸乙酯的存在，到發酵7 d時色譜峰達到峰值。其他物質在發酵過程中含量波動變化、不穩定，發酵過程中這些物質有可能存在生成及轉化兩方面的作用，還有待進一步研究。酵母YS/Y/22發酵產生乙酸乙酯的能力較強，而乙酸乙酯屬于大曲酒的主要酯類香味成分，因此，可確定酵母菌株YS/Y/22為陶香型白酒的產香功能菌。

2.3產香菌株鑒定結果（圖2、圖3、圖4）

經對YS/Y/22菌體進行DNA提取、目的片段PCR擴增后[8]，將PCR產物送往上海杰里公司測序，測序結果在GeneBank數據庫中進行比對，結果表明，菌株YS/Y/22與 Wickerhamomyces anomalus FJ972217.1相似性為99%。利用Mega5.05軟件通過N-J法對菌株YS/Y/22構建系統發育樹，結果見圖2。菌株YS/Y/22的菌落及菌體形態見圖3、圖4。根據菌株rDNA的相似性、系統發育樹和菌體形態，初步鑒定菌株YS/Y/22為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomycesanomalus）。

圖2　基于18S rDNA序列同源性構建的菌株YS/Y/22系統發育樹

圖3　酵母YS/Y/22菌落形態圖

圖4　酵母YS/Y/22菌體形態圖

3　結論

本研究采用了單菌發酵實驗研究從陶香型窖池糟醅中篩選出的酵母微生物，共篩選出6株產香酵母，其中菌株YS/Y/22產香能力最強，其揮發性香味成分主要是具有酒香味和水果香味的乙酸乙酯，屬于陶香型白酒的香味成分之一。經分子生物學鑒定，菌株YS/Y/22為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。對于酵母YS/Y/22的產香機理和影響因素以及多菌共同發酵的效果、相互作用等將在后續研究中陸續進行，以期早日運用于生產實踐，改善原酒口感提高技術參考。

[1]樊建輝,侯建光,郭富祥,等.仰韶超高溫大曲發酵過程中微生物變化的初步分析[J].釀酒,2015,42(1)：49-51.

[2]侯建光,郭富祥,樊建輝,等.寒暑季節仰韶陶香型大曲指標差異性研究[J].釀酒,2016,43(1)：23-25.

[3]侯建光,郭富祥,樊建輝,等.夏季仰韶陶香型中高溫大曲曲表和曲心指標動態演變的研究[J].釀酒科技,2016(3)：88-89.

[4]侯建光,韓素娜,樊建輝,等.應用HS-SPME和GC-MS淺析陶香型白酒中揮發性成分[J].釀酒,2016(3)：37-40.

[5]Zhang R,Wu Q,Xu Y.Aroma characteristicsofMoutai flavor liquor producedw ith Bacillus licheniformis by solid state fermentation[J].Letters in Applied M icrobiology,2013,57(1)：11-18.

[6]羅惠波,楊曉東,楊躍寰,等.濃香型大曲中可培養真菌的分離鑒定與系統發育學分析[J].現代食品科技,2013,29(9)：2047-2052.

[7]明紅梅,郭志,周健,等.濃香型大曲中產香微生物的篩選及鑒定[J].現代食品科技,2015,31(4)：186-191.

[8]Yeg B,Wang SF,Jiang L J,etal.Distribution and diversity of Bacteria and Archaea inmarine sedimentsaffected bygas hydratesatM ississippiCanyon in theGulfofMexico[J].geom icrobiology Journal,2009,26(6)：370-381.

Screening and Identification of a Strain w ith High Yield of Ethyl Acetate from Taoxiang Pits

HOU Jianguang,GUO Fuxiang,FAN Jianhui,HAN Su'na,ZHANG Junfeng and CHENMengen
(Yangshao Distillery Co.Ltd.,M ianchi,He'nan 472400,China)

In the experiments,25 yeaststrainswere isolated from fermentedgrains in Taoxiang pits in different fermenting stagesby traditional m icrobe isolationmethods.Then bean sproutsmedium was used as the substrate for aroma-producing experiment of each single yeast strain. Aroma assessment suggested that yeast strain YS/Y/22 could produce strong fruit aroma and w ine aroma.The volatile compounds of such strainwere analyzed by HPLC-GC-MSand itwas found that itsmain flavoring compound wasethylacetate,whichwasoneof themost important flavoring compounds in Daqu.Accrodingly,strain YS/Y/22 was an aroma-producing functionalm icrobial strain.Itwas identified as Wickerhamomycesanomalus throughmorphologicalobservation andmolecularbio-assay.(Trans.by YUEYang)

Taoxiang pits;aroma-producingm icrobes;volatile compounds;screening;identification

TS262.1；TS261.4；TS261.3；Q93-3

A

1001-9286（2016）11-0056-04

10.13746/j.njkj.2016227

2016-07-15

侯建光(1968-)，男，在職研究生，高級工程師，E-mail：610365356@qq.com。

樊建輝(1976-)男，大專，工程師，E-mail：fanjianhui2006@163.com。