不同工藝對麩曲中酸性蛋白酶活性的影響

程 偉，卓毓崇，楊 柳，王 西，甘浪飛，陳夢園，羅愛民

（1.四川郎酒集團有限責任公司，四川古藺646523； 2.四川大學輕紡與食品學院，四川成都610065）

不同工藝對麩曲中酸性蛋白酶活性的影響

程 偉1，卓毓崇1，楊 柳1，王 西1，甘浪飛1，陳夢園2，羅愛民2

（1.四川郎酒集團有限責任公司，四川古藺646523； 2.四川大學輕紡與食品學院，四川成都610065）

以1株蛋白酶活性較高的菌株為種子培養液，通過改變麩曲培養基配比、培養時間和培養前接種量3個因素，研究不同工藝對麩曲中酸性蛋白酶活性的影響。結果表明，選擇麩皮80%、谷殼20%的配比制作麩皮培養基，培養時間為55 h，菌液接種量為1%的條件，麩曲中酸性蛋白酶活性可以達到最大值。

麩曲； 工藝； 酸性蛋白酶； 活性

白酒在我國已有幾千年的歷史[1]，它主要以香味獨特、酒體醇厚、幽雅細膩、空杯留香等特點而深受消費者喜愛[2-3]。莊名揚的研究發現白酒的獨特性質與其特定的生產工藝有關[4]。沈玉潔等[5]從大曲中分離篩選出具有較高活性的酸性蛋白酶，在大曲制作的傳統工藝基礎之上，引入一定量的酸性蛋白酶制成麩曲來提升酒質貴州省輕工業科學研究所生產的麩曲在提高酒的質量上有明顯的作用[4]。應用純種微生物制成麩曲應用到白酒的生產中，是以后科研工作的努力方向[6]。周恒剛發現在白酒多次發酵過程中，隨著酒醅中殘留蛋白質越來越少，酒味越來越寡淡，提出白酒中許多香味成分來自蛋白質和蛋白酶[7]。但這并不是說蛋白質含量越高，蛋白酶活力越高，白酒中香味成分就越高，酒質就越好。在白酒的生產過程中，酒糟通過堆積后，經過微生物的發酵呈偏酸性，在酵池中發揮作用的主要是酸性蛋白[8]。在白酒生產過程中，高級醇也主要來源于酸性蛋白酶分解蛋白質所生成，酸性蛋白酶與白酒中香味物質的形成有著密切的關系，因此適當提高麩曲中酸性蛋白酶活力以使其能在發酵過程中更好地發揮作用就顯得非常重要[9]。

影響麩曲中酸性蛋白酶活性的因素的研究報道較為少見。本實驗以高溫大曲中篩選出的1株產蛋白酶活力較高的細菌作為種子菌，通過研究不同制作工藝對麩曲中酸性蛋白酶的影響，并優化培養條件，以期得到麩曲中酸性蛋白酶活力較高時的制作工藝，為后續麩曲的研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

材料：菌株DQ-34，Bacillus subtilis，保存于四川大學輕紡與食品學院食品科學與工程新技術研究室；谷殼、麩皮和小麥粉（由酒廠提供）。

試劑：福林試劑、0.4mol/L碳酸鈉溶液、0.4mol/L三氯醋酸溶液、10 g/L酪蛋白溶液、pH3.0乳酸-乳酸鈉緩沖液。

儀器：G2-250-HIS型恒溫恒濕培養箱，韶關市廣智科技設備有限公司；WH-2型微型漩渦混合儀，上海滬西分析儀器廠有限公司：SW-CJ-2F型潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；立式透明門冷藏柜、手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器、721型分光光度計等。

1.2 培養基

牛肉膏蛋白胨培養基（g/L）：牛肉膏5，蛋白胨10，氯化鈉5，瓊脂20，pH7.0～7.2，121℃滅菌30m in，備用。

LB液體培養基（g/L）：蛋白胨10，酵母膏5，氯化鈉10，pH7.0，121℃滅菌20m in，備用。

1.3 實驗方法

1.3.1 接種前培養液細菌密度的確定

取DQ-34斜面菌種1支，以無菌操作方式挑取并在牛肉膏蛋白胨培養基上劃平板，37℃條件下倒置培養24 h。培養完成后選擇單菌落，無菌環境下挑取1環于40m L的LB培養液內，37℃條件下160 r/m in搖床培養，每隔1 h取出1次，無菌條件下搖勻測培養液在600 nm條件下的OD值，并取出1m L培養液，梯度稀釋后取其中3個梯度的稀釋液進行平板涂布，37℃條件下倒置培養24 h后計數。

1.3.2 酸性蛋白酶酶活性測定

酸性蛋白酶活力測定采用福林酚法[10]，酸性蛋白酶活力單位定義：1 g酶粉在40℃、pH3.0條件下，1m in水解酪蛋白產生1μg酪氨酸，即為1個酸性蛋白酶活力單位，以U/g表示。

1.3.3 麩曲培養基配比對酸性蛋白酶活力影響

清蒸后的谷殼添加量為20%，分別混合80%的麩皮、60%的麩皮配20%的小麥粉、40%的麩皮配40%的小麥粉、20%的麩皮配60%的小麥粉、80%的小麥粉制作麩皮培養基，原料混勻后加60%～65%的水充分拌和。常壓條件下蒸1 h，冷卻后分裝進1 L的三角瓶后用雙層紗布封口，于121℃、0.1MPa條件下滅菌30m in。將滅菌完成的麩皮培養基在無菌操作臺中冷卻，備用。向各培養基接種體積質量分數為3%（v∶m=3m L∶100 g）的種子培養液，搖勻后以37℃培養72 h，培養結束后取出，40℃烘干24 h，粉碎測酸性蛋白酶活力[11]，每個配比組合做3個平行樣。

1.3.4 麩曲培養時間對酸性蛋白酶活力影響

在滅菌冷卻后的麩皮培養基（20%谷殼、80%麩皮）中接種體積質量分數為3%的種子培養液，搖勻后于37℃條件下分別培養45 h、50 h、55 h、60 h、65 h和70 h，培養結束后取出，40℃烘干24 h，粉碎測酸性蛋白酶活力，每種培養時間做3個平行樣。

1.3.5 麩曲培養前接種量對酸性蛋白酶活力影響

在滅菌冷卻后的麩皮培養基（20%谷殼、80%麩皮）中分別接種體積質量分數為1%、2%、3%、4%、5%的種子培養液，充分搖勻后在37℃條件下培養55 h，培養結束后取出，40℃烘干24 h，粉碎測酸性蛋白酶活力，每種接種量做3個平行樣。

2 結果與分析

2.1 菌株DQ-34液體培養生長動態

培養時間從1～3 h細菌數量緩慢增長，OD值變化小（從0.026到0.040）。培養時間從3 h到6 h細菌數量增長迅速，OD值由0.040增加到0.420。之后隨著培養時間的繼續延長，細菌數量增長速度逐漸放緩，當培養時間為9 h時，培養液中細菌總數的對數值達到8.821，OD值達到1.060。

由圖1可知，為了保證每次接種到麩皮培養基中的細菌的數量和生長狀態一致，選取對數期接近穩定期的細菌作為種子細菌，當LB液體培養基600 nm條件下OD值為0.700左右時，停止培養并進行麩皮培養基接種。

圖1 細菌DQ-34生長曲線

2.2 麩皮培養基配比對產酸性蛋白酶的影響

用不同配比的麩皮和小麥粉制成的培養基培菌完成后測其酸性蛋白酶活力值，其結果見圖2。圖2表明，隨著培養基中麩皮含量的降低，酸性蛋白酶活力值呈現先降低后升高再降低的變化規律。

圖2 麩皮培養基配比對DQ-34產酸性蛋白酶的影響

酸性蛋白酶活力在麩皮含量80%時其酸性蛋白酶活力最高（19.003U/g），而在麩皮和小麥粉含量各為40%時最低（9.304 U/g），之后隨著麩皮含量的增加逐漸增大，但是仍低于麩皮含量較高時的值。麩皮含量高時培養基較蓬松，DQ-34是好氧性細菌，在氧氣較充足的條件下能更好地生長，相應產生的蛋白酶也較多，所以麩皮含量從80%降到60%、40%時，酸性蛋白酶活力也迅速下降達到16.250U/g、9.304U/g。麩皮含量降到20%時，蛋白酶活力不降反升，為12.767U/g，當麩皮含量為0%時，蛋白酶活力稍有下降，為12.331U/g，這與小麥粉中蛋白質含量比麩皮中的高，培養前期培養基較蓬松時積累了一定的蛋白酶有關。隨著培養時間的延長，培養過程中產生的水吸附在培養基質上不易排出，細菌生長速度減緩，培養結束后其酸性蛋白酶活力較低。

2.3 麩曲培養時間對產酸性蛋白酶的影響

培養時間的長短對微生物的生長速度和代謝能力有著重要的影響[12]。由圖3可知，在所選的6個時間點中，培養時間為45 h時，酸性蛋白酶活力最低，只有17.214U/g，培養時間為50 h時，酸性蛋白酶活力為19.204 U/g。55 h時酶活力達到最大值30.101 U/g，之后延長培養時間到60 h、65 h時，酶活力逐漸下降到24.639U/g、22.681U/g。當培養時間為70 h時，酸性蛋白酶活力值已經降到19.679U/g。隨著培養時間的延長，酸性蛋白酶活力在開始的55 h內呈逐漸上升趨勢，說明此時的菌體數在不斷增長，達到頂點后隨時間的推移逐漸下降，說明在底物不斷消耗的同時，菌體生長也進入衰亡期，導致產酶及酶活性也逐漸下降。

圖3 麩曲培養時間對DQ-34產酸性蛋白酶的影響

2.4 麩曲接種量對產酸性蛋白酶的影響

不同接種量的麩曲培養完成后酸性蛋白酶活力值變化情況見圖4，由圖4可知，當接種量從1%增加至5%的過程中，酸性蛋白酶活力從97.145 U/g開始一直下降，分別為81.393U/g、30.101U/g、24.270U/g、5.706U/g。

酸性蛋白酶活力與接種量呈負相關，這可能是因為隨著接種量的增加，進入麩皮培養基的初始細菌數量增加，培養基的消耗速度加快，這些處于對數期的種子細菌更快地結束了調整期，通過了對數期進入了穩定期并接著走向衰亡期，而酸性蛋白酶主要產生于對數期，所以對數期時間持續長的麩皮培養基培養完成后酸性蛋白酶活力就高。從這一方面來看，適當減少接種量有助于延長種子細菌在麩皮培養基中對數期持續的時間，增加酸性蛋白酶活力。

3 結論

圖4 麩曲接種量對DQ-34產酸性蛋白酶的影響

本研究探討了麩曲中產蛋白酶菌中的酸性蛋白酶活性與不同制作工藝的關系，得到了麩曲中酸性蛋白酶活力最大時的制作工藝。麩曲培養基的配比對酸性蛋白酶的影響與王秋辰[13]等在固態發酵中酸性蛋白酶條件優化中結果一致。隨著培養基中麩皮用量的降低，酸性蛋白酶活力值呈現先降低后升高再降低的變化規律。隨麩曲培養時間的延長，酸性蛋白酶活力在開始的55 h內呈逐漸上升趨勢，達到頂點后隨時間的推移逐漸下降。隨著麩曲接種量的增加，酸性蛋白酶活力呈下降趨勢。最終確定麩曲在麩皮80%、谷殼20%的配比制作麩皮培養基，并在培養時間為55 h，菌液接種量為1%的條件下時酸性蛋白酶的活性最大。

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Influenceof Different Techniqueson Acid Protease Activity in Fuqu

CHENGWei1,ZHUOYuchong1,YANG Liu1,WANG Xi1,GAN Langfei1,CHENMengyuan2and LUOAimin2
(1.Sichuan Langjiu Group Co.Ltd.,Gulin,Sichuan 646523;2.College of Light Industry, Textileand Food Engineering,Sichuan University,Chengdu,Sichuan 610065,China)

Using a strain w ith high protease activity as the seed,we investigated the influence of different techniques on acid protease activity in Fuqu by changing the culture composition,the culture time and the inoculation quantity.The results showed that,the highestacid protease activity was achieved when the culture consisted of 80%bran and 20%husk,culture timewas 55 h,and inoculation quantity was 1%.(Trans. by HUANG Xiaoli)

Fuqu;technique;acid protease;activity

TS262.3；TS261.4

A

1001-9286（2016）12-0040-03

10.13746/j.njkj.2016349

四川省科技成果轉化專項資金項目（2014SC0013）。

2016-11-24

程偉（1973-），男，本科，白酒國家評委，郎酒集團公司高級工程師，主要從事白酒嘗評、勾調和釀酒生產科研工作。

羅愛民（1971-），男，四川大學副教授，博士，主要從事釀酒生產科研工作。

優先數字出版時間：2016-12-02；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20161202.1631.007.htm l。