調節黑曲霉脂肪酶催化合成己酸乙酯的探索

詹美榕，丁俊竹，叢方地，，邢克智，周文禮，張樹林

（1.天津農學院基礎科學學院生物制藥系，天津300384； 2.天津市水產生態與養殖重點實驗室，天津300384）

調節黑曲霉脂肪酶催化合成己酸乙酯的探索

詹美榕1，丁俊竹1，叢方地1，2，邢克智2，周文禮2，張樹林2

（1.天津農學院基礎科學學院生物制藥系，天津300384； 2.天津市水產生態與養殖重點實驗室，天津300384）

為提高己酸乙酯的酶促合成效果，通過物理吸附，將黑曲霉脂肪酶（Aspergillus niger Lipase,ANL）固定在柱形玻璃瓶的內壁上，形成簡易的生物反應器，用于催化己酸和無水乙醇反應，合成己酸乙酯。在己酸與乙醇的體積比為0.6∶3.5的無溶劑體系中，酶的用量占反應體系0.24%，反應條件為37℃、160 r/min。研究表明，固定化過程中，水可以優化ANL的催化活性，羧甲基纖維素CMC能更好地優化ANL。在催化過程中，無水硫酸鈉可以通過吸水作用，拉動平衡增大轉化率，無水碳酸鈉可中和己酸，進一步提高反應的轉化率。反應時間24 h，轉化率最高可達91.0%。

己酸乙酯； 脂肪酶； 固定化； 催化活性； 非水相

己酸乙酯是符合我國食品衛生安全標準的食用香料，用途十分廣泛[1]，尤其它是濃香型白酒的主體香味成分[2]，市場需求量極大[3]，需要通過合成來提供[4]。合成己酸乙酯通常采用的化學催化合成法，副產物多，后期處理困難且嚴重腐蝕實驗設備，對環境也有嚴重污染[5]。而酶催化合成法，具有效率高、有選擇性及條件溫和等優點[6]因此，此法副產物少、環境友好且對設備無特殊要求[7]用于合成己酸乙酯時，產品質量高，香味醇正[8]。特別是非水相中的脂肪酶催化方法[9]，利于酯的形成，用于合成己酸乙酯更為方便[10]。脂肪酶催化合成己酸乙酯多使用有機介質，如正己烷或正庚烷溶劑下催化合成[11]，而酶催化己酸和無水乙醇合成己酸乙酯的無溶劑體系，產品后期處理更簡單，環境污染較小，但因為反應體系的極性較高，易造成酶蛋白變性而降低催化活性，所以現在對無溶劑體系酶催化合成己酸乙酯的研究相對較少[12]。本研究擬通過固定化、吸水劑和中和試劑的調節作用，穩定黑曲霉脂肪酶（Aspergillusniger Lipase,ANL）的催化活性，提高無溶劑體系酶催化合成己酸乙酯的效果。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

材料：黑曲霉脂肪酶ANL購于杭州創科生物科技有限公司（12000 U/g），羧甲基纖維素（CMC）由施瑞客（天津）生物技術有限公司提供，正己酸、無水乙醇和無機鹽皆為分析純。

儀器：全溫振蕩器（HZQ-Q，哈爾濱）；氣相色譜儀(GC，Echrom A90，上海)，配有氫火焰檢測器和毛細管柱（SE-30 30m×0.32mm×0.33μm）。

1.2 ANL固定化

在10m L柱形玻璃瓶內，加10mg的ANL酶粉，再加0.2m L濃度為0.05%的CMC溶液（或0.2m L水），將其敞口固定在全溫振蕩器中，以37℃、160 r/m in保持7 h以上，至恒重，得固定于瓶內壁上的固定化酶CMC-ANL（或水-ANL）。

1.3 酶促反應

向含有ANL酶粉、水-ANL或CMC-PCL的柱形玻璃瓶反應器（3種酶制劑含ANL皆為10mg）中，加入0.6m L正己酸和3.5m L無水乙醇（mol:mol,1∶12.5），封口后固定在恒溫振蕩器中，以37℃、160 r/m in反應。

1.4 調節反應

向上述含有3種酶制劑和反應液的3個反應器中，分別加入10mg的無水Na2SO4或無水Na2SO4+無水Na2CO3（各10mg），然后封口并固定在恒溫搖床中，以37℃、160 r/min保持24 h。

1.5 動力學分析

取反應液1μL，用1m L正己烷稀釋，經0.25μL微孔濾膜過濾，然后進行GC分析。進樣口溫度280℃，壓力3 psi；柱程序：130℃保留5 m in，以80℃/m in升至280℃，保留6m in；檢測器溫度300℃。己酸和己酸乙酯的保留時間分別為：7.58m in和7.86m in。轉化率c(%)按下式計算：

2 結果與討論

2.1 ANL酶促反應動力學

圖1 酶促合成己酸乙酯

ANL酶催化己酸與無水乙醇發生酯化反應生成己酸乙酯，見圖1。為利于反應向右進行，乙醇使用過量。ANL酶粉、水-ANL和CMC-ANL催化合成乙酸己酯反應的動力學曲線見圖2，它們轉化底物的能力由小到大的次序為ANL酶粉＜水-ANL＜CMC-ANL。這是因為，在有機體系中，酶蛋白容易變性[13]，因而ANL酶粉活性較低。固定化過程中，使用的水在一定程度上可以優化酶蛋白，因而水-ANL的活性高于酶粉。固定化過程中，使用的CMC是一種多羥基大分子[14]，類似于水分子，可替代水在有機相中穩定酶的構象[15]，因而CMC-ANL活性更高。

圖2 3種ANL催化合成己酸乙酯反應的轉化率

2.2 無水Na2SO4對反應平衡的拉動

依據參考文獻[16]，ANL催化合成己酸乙酯的條件設為37℃和160 r/m in。因反應有水生成（如圖1），向反應體系中加入吸水劑，理應拉動反應向右進行。加入10mg無水Na2SO4后，反應的轉化率有明顯提高，ANL酶粉、水-ANL和CMC-ANL催化的反應體系的轉化率分別提高到61.6%、74.4%和82.7%（表1）。相對于未加吸水劑之前，轉化率分別提高了7.4%、9.7%和10.2%。尤其是在CMC-ANL催化的反應體系中，無水Na2SO4使反應轉化率明顯升高，約增加10.2%/10mg Na2SO4；而在硅膠作為吸水劑的正己烷溶劑體系中，經計算，約增加1.2%/10mg硅膠[17]，前者是后者的8.3倍。在具體生產過程中，如果要進一步提高轉化率，可適當再增加無水Na2SO4的用量。

表1 Na2SO4和Na2CO3對反應轉化率的影響

2.3 中和劑對酶催化作用的影響

ANL的最佳作用pH值為8[18]，因此與非極性溶劑體系相比較[17]，在極性較大的己酸和乙醇的混合液中，己酸能電離出質子，不利于ANL發揮催化作用的。為此，研究設想用無水Na2CO3來中和反應體系中的過多質子。結果表明，在Na2SO4和Na2CO3共存時，能夠更有效地提高反應體系的轉化率，使ANL酶粉、水-ANL和CMCANL催化的反應轉化率分別進一步提高到72.3%、81.9%和91.0%（表1）。相對于未加無水Na2CO3的體系，轉化率又分別提高了10.6%、7.5%和8.3%。尤其是CMC-ANL催化的反應體系，CMC、Na2SO4和Na2CO3共同作用的結果，使轉化率達到91.0%（見圖3）。

圖3 Na2SO4和Na2CO3共存在時CMC-ANL催化反應24 h的GC圖

3 結論

以0.2m L濃度為0.05%的CMC水溶液，溶解脂肪酶ANL，通過物理吸附法，將其固定在玻璃瓶壁上，制備出固定化酶CMC-ANL，與反應器一起形成簡易的固定化酶生物反應器。在催化合成己酸乙酯的無溶劑體系過程中，CMC-ANL的非水相活性和穩定性明顯增加。添加吸水劑無水Na2SO4可以拉動反應，使反應轉化率從72.5%上升到82.7%，添加中和劑無水Na2CO3，可以使反應轉化率進一步上升到91.0%。

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Exp loring the Regulation of Synthesisof EthylCaproate Catalyzed by Aspergillusniger Lipase

ZHAN Meirong1,DING Junzhu1,CONG Fangdi1,2,XING Kezhi2,ZHOUWenli2and ZHANG Shulin2
(1.Departmentof Biopharmaceutics,College of Basic Science,Tianjin AgriculturalUniversity,Tianjin 300384; 2.Tianjin Key Lab ofAquatic Ecology and Aquaculture,Tianjin 300384,China)

To improve the catalysis of Aspergillus niger lipase(ANL)in the synthesis of ethyl caproate,lipasewas immobilized on the inner wallof column glassbottle by physical absorption to form a facile bioreactor and then used in the reaction of caproic acid w ith ethanol to synthesize ethyl caproate.In solvent-free system w ith caproic acid and ethanol in a ratio of 0.6∶3.5(V∶V),ANL dosagewas 0.24%of this reaction system to catalyze theesterification at37℃and 160 r/min.Itwas showed that,water employed in the immobilization couldmodify the catalysisof ANL and carboxymethyl cellulose(CMC)could give better help on ANL.During the course of catalysis,anhydrous sodium sulfate could absorbwaterand pull reaction equilibrium to enhance reaction conversion,and anhydrous sodium carbonate could neutralize caproic acid to further increase reaction conversion.After24 h,the reaction conversion achieved at91.0%.

ethylcaproate;lipase;immobilization;catalytic activity;nonaqueousphase

TS262.3；TS261.4；Q814

A

1001-9286（2016）12-0028-03

10.13746/j.njkj.2016270

天津市水產生態及養殖重點實驗室開放基金項目(TJAE201502)；國家自然科學基金項目(31270456)。

2016-09-05

詹美榕（1993-），女，研究方向：食品添加劑的酶促合成。

叢方地。

優先數字出版時間：2016-11-04；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20161104.1415.004.htm l。