α1抗胰蛋白酶治療皮膚光老化的作用及對抗氧化物水平的影響

秦 錚 張桂云 劉騰飛 楊文娟 姚春麗

(吉林大學第二醫院皮膚科，吉林 長春 130041)

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α1抗胰蛋白酶治療皮膚光老化的作用及對抗氧化物水平的影響

秦 錚 張桂云 劉騰飛 楊文娟 姚春麗

(吉林大學第二醫院皮膚科，吉林 長春 130041)

目的 探討α1抗胰蛋白酶(AAT)對豚鼠皮膚光老化的治療作用并檢測皮膚組織中抗氧化物的變化。方法 60只健康雌性豚鼠隨機分為空白組(SC)、預防治療組(Pre)和模型組(MC)，建立光老化模型，Pre組造模同時給予AAT預防治療。酶聯免疫吸附法(ELISA)試劑盒檢測皮膚組織勻漿中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、羥脯氨酸(Hyp)、丙二醛(MDA)的含量。結果 與SC組相比，MC組皮膚組織中MDA 含量明顯增多，GSH-Px、SOD 活力及Hyp含量降低(P<0.05)；與MC組相比，AAT治療后MDA 減少，GSH-Px、SOD活力及Hyp含量增加(P<0.05)。結論 AAT可延緩和治療豚鼠皮膚光老化，其作用機制可能與提高老化皮膚組織中抗氧化物含量并抑制氧化還原反應有關。

皮膚光老化；α1抗胰蛋白酶(AAT)；抗氧化物

皮膚光老化是指暴露部位皮膚由環境因素如紫外線輻射、風吹、日曬及接觸有害化學物質等引起的急、慢性損傷，而紫外線是最重要的影響因素〔1〕。皮膚光老化的臨床表現包括暴露部位皮膚皺紋、色素沉著、皮膚粗糙、干燥脫屑、膚色灰黃、毛細血管擴張、皮革樣外觀等，嚴重的可引起癌前病變，甚至皮膚惡性腫瘤〔2～4〕。大量研究證實α1抗胰蛋白酶(AAT)是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，具有抗感染、調節免疫、抑制細胞凋亡、維系人體生理循環等作用，但在皮膚光老化中的應用報道極少。本實驗旨在探討AAT對皮膚光老化的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 白色健康雌性豚鼠60只，體重(220±20)g，長春市億斯實驗動物技術有限責任公司提供。

1.1.2 試劑 甲氧沙林溶液(邦力)：重慶華邦制藥有限公司；AAT：佛羅里達大學藥學院提供；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、羥脯氨酸(Hyp)、丙二醛(MDA)試劑盒：購于南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 建立豚鼠皮膚光老化模型及分組 60只豚鼠隨機分為空白組(SC)和模型組(MC)，應用甲氧沙林聯合UVA+UVB造模。MC組中隨機選取6只為預防治療組(Pre)，造模同時給予AAT 20 mg/只預防治療。造模成功后隨機分為陽性組(Pos)、外用高(EH)、低劑量組(EL)、腹腔注射高(IH)、低劑量組(IL)、陰性對照組a(VC-a，腹腔注射鹽水)、陰性對照組b(VC-b，外用凝膠)，進行相應干預治療。治療2 w后觀察各組豚鼠皮膚外觀變化。

1.2.2 檢測組織中抗氧化酶活性和MDA含量 治療結束，將動物處死，取照射區新鮮皮膚組織制成10%組織勻漿，離心提取上清液。采用酶聯免疫吸附法(ELISA)分別測SOD、GSH-Px、Hyp、MDA含量。

1.3 統計學分析 采用SPSS22.0軟件行ANOVA分析。

2 結 果

2.1 不同干預治療后大體及病理變化 AAT治療后，各組皺紋、皮屑、色素沉著等均有所改善。Pre、IH組皺紋明顯淡化，無明顯靜態皺紋，無皮屑及色素沉著；HE染色皮膚略增厚。IL組皺紋也明顯變淺，僅見少量細小靜態周圍，有極少量皮屑和輕度色素沉著；HE染色見皮膚較IH組厚，皮膚結構完整，纖維組織排列不規則，有少量炎癥細胞浸潤。Pos組暴露部位皮膚淺在靜態皺紋，僅有少量皮屑，色素沉著不明顯；HE染色見皮膚較SC組增厚，結構稍有異常，纖維組織排列部分不規則，有少量炎癥細胞浸潤。VC-a、VC-b組皮膚有明顯靜態皺紋，大量皮屑，色素沉著明顯，皮膚彈性差，缺乏光澤；HE染色見皮膚明顯增厚，纖維組織排列紊亂，有炎細胞浸潤。見圖1。

2.2 AAT對皮膚組織中抗氧化酶活力的影響 與SC組相比，MC組SOD、GSH-Px、Hyp均下降(P<0.05)。而與MC組相比，治療組(包括AAT預防治療、AAT腹腔注射、AAT外用、維甲酸治療)SOD、GSH-Px、Hyp均升高(P<0.05)。相同劑量AAT治療(包括預防治療、腹腔注射高劑量、外用高劑量)后SOD、GSH-Px、Hyp的變化無統計學意義(P>0.05)。AAT高劑量組(包括腹腔注射和外用)組織中SOD、GSH-Px、Hyp的變化較低劑量組(包括腹腔注射和外用)明顯(P<0.05)。與陽性組相比，AAT高劑量組(包括腹腔注射和外用)中SOD、GSH-Px、Hyp變化明顯(P<0.05)。 見表1。

2.3 AAT對皮膚組織中MDA的影響 與SC組相比，MC組MDA升高(P<0.05)，而與MC組相比，治療組(包括AAT預防治療、AAT腹腔注射、AAT外用、維甲酸治療)MDA降低(P<0.05)。相同劑量AAT治療(包括預防治療、腹腔注射高劑量、外用高劑量)后MDA的變化無統計學意義(P>0.05)。AAT高劑量組(包括腹腔注射和外用)MDA的變化較低劑量組(包括腹腔注射和外用)明顯(P<0.05)。與陽性組相比，AAT高劑量組(包括腹腔注射和外用)中MDA變化明顯(P<0.05)。見表1。

圖1 不同組治療后病理變化(HE染色)

組別SOD(U/mg)GSH-Px(U/mg)Hyp(μg/mg)MDA(nmol/mg)SC35.78±2.841)208.30±13.221)6.35±0.991)10.58±1.371)MC10.51±1.77105.21±9.963.62±0.9321.94±4.96Pre35.19±3.301)196.62±13.881)5.69±1.291)12.27±3.501)IH34.96±3.331)2)4)178.26±17.461)2)4)5.81±1.771)2)4)13.37±2.011)2)4)IL21.94±3.711)158.68±17.891)4.46±1.291)18.74±3.191)EH34.73±4.291)2)4)179.91±22.171)2)4)5.38±1.491)2)4)13.82±4.761)2)4)EL22.23±3.461)153.50±21.701)4.05±1.101)18.11±3.921)Pos29.00±4.921)170.52±20.531)4.81±1.331)16.88±2.981)VC-a10.78±2.91105.08±12.444.00±1.1620.85±1.84VC-b10.44±2.33104.75±10.603.70±0.9320.79±4.78

與MC組比較：1)P<0.05，與IL組比較：2)P<0.05；與EL組比較：3)P<0.05；與POS組比較：4)P<0.05

3 討 論

皮膚光老化多由過度紫外線照射引起氧化應激反應導致，而人體皮膚有復雜的內源性抗氧化防御體系來對抗氧化應激反應。一般情況下，內源性抗氧化酶(SOD、GSH-Px等)能夠有效地清除紫外線照射產生的自由基，以保護皮膚組織。但是，過度或長期暴露于紫外線中，組織內產生大量自由基，超過皮膚內源性抗氧化能力，造成組織代謝紊亂，結構破壞，最終皮膚表現出光老化癥狀，故提高抗氧化物活力是目前延緩皮膚老化的有效方法。

過量的自由基使皮膚組織中抗氧化體系破壞，導致氧化性損傷，使抗氧化酶活性下降及脂質過氧化產物堆積；大量自由基還可破壞DNA結構，使DNA鏈斷裂、堿基氧化〔5，6〕。SOD可以有效清除機體內的自由基，防止或減輕自由基對機體的損傷，GSH-Px的活力是衡量機體抗氧化水平的重要指標。Hyp含量可推斷皮膚老化程度〔7〕。本實驗證實了光老化皮膚組織中抗氧化物含量減少，AAT可增加機體抗氧化反應的能力。MDA含量可反映機體脂質過氧化程度，間接反映細胞受損程度。紫外線照射通過催化脂質過氧化反應引起MDA增加，AAT治療組后MDA含量明顯減少，可推斷AAT有抑制脂質過氧化反應的作用。AAT是分子量為52 kD的單鏈糖蛋白，能抑制多種絲氨酸內切肽酶如彈性蛋白酶、胰蛋白酶、血漿素、凝血酶等蛋白酶的活性，以保護正常細胞和器官不受蛋白酶的損傷，維持機體內環境平衡。AAT還可通過與組織中性粒細胞相互作用，抑制活性氧的產生，起到抗炎作用〔8〕。本實驗證實了AAT易被吸收，給藥途徑不影響其吸收效果，且AAT的治療效果在一定濃度范圍內與濃度相關。

1 Zhuang Y，Hou H，Zhao X，etal.Effects of collagen and collagen hydrolysate from jellrfish(Rhopilema esculentum)on mice skin photoaging induced by UV irradiation〔J〕.J Food Sci，2009;74(6)：H183-8.

2 Yaar M，Eller MS，Gilchrest BA.Fifty years of skin aging〔J〕.J Invest Dermatol Symp Proc，2002;7(1):51-8.

3 Pandel R，Polj?ak B，Godic A，etal.Skin photoaging and the role of antioxidants in its prevention〔J〕.Isrn Dermatology，2013;2013(2013):930164.

4 Berneburg M，Plettenberg H，Krutmann J.Photoaging of human skin〔J〕.Photodermatol Photoimmunol Photomed，2000;16(6):239-44.

5 Ryoo YW，Suh SI，Mun KC，etal.The effects of the melatonin on ultraviolet-B irradiated cultured dermal fibroblasts〔J〕.J Dermatol Sci，2001;27(3):162-9.

6 Gilchrest BA.Photoaging〔J〕.J Am Acad Dermatol，2013;133(1):2-6.

7 Feng Y，Xu J，Qin Z，etal.Alpha-1 antitrypsin prevents the development of preeclampsia through suppression of oxidative stress〔J〕.Front Physiol，2016;7(119).

8 Bergin DA，Hurley K，Mcelvaney NG，etal.Alpha-1 antitrypsin: a potent anti-inflammatory and potential novel therapeutic agent〔J〕.Arch Immunol Et Ther Exp，2012;60(2):81-97.

〔2016-10-20修回〕

(編輯 曲 莉)

吉林省省級經濟結構戰略調整引導資金專項項目(No.2015Y030-1)； 吉林省科技發展計劃重點科技攻關項目(No.20140204021YY)

姚春麗(1970-)，女，主任醫師，碩士生導師，主要從事皮膚外科疾病研究。

秦 錚(1990-)，女，在讀碩士，主要從事皮膚外科疾病研究。

R332

A

1005-9202(2016)23-5827-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.023