硫酸鋅對糖尿病皮膚損傷的修復作用

張海峰 呂 游 王洪莎 魏 祺 雷嫚嫚 郭蔚瑩

(吉林大學第一醫(yī)院介入治療科，吉林 長春 130021)

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硫酸鋅對糖尿病皮膚損傷的修復作用

張海峰 呂 游1王洪莎1魏 祺1雷嫚嫚1郭蔚瑩1

(吉林大學第一醫(yī)院介入治療科，吉林 長春 130021)

目的 研究硫酸鋅對糖尿病伴有皮膚創(chuàng)面愈合的影響。方法 采用鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射制備糖尿病大鼠模型(48只)，成模1個月后，進行背部9 cm2銳器皮膚損傷。爾后分2組：1組在傷愈過程中局部涂抹硫酸鋅，另1組局部涂抹生理鹽水自然愈合。以正常大鼠皮膚損傷為對照組(48只)。在創(chuàng)面愈合的不同時間點，采用創(chuàng)面愈合百分率計算大鼠皮膚創(chuàng)面愈合速度；通過免疫組織化學染色、實時定量PCR檢測動態(tài)觀察糖尿病創(chuàng)面愈合的過程及其組織學變化特征。 結果 第15天時，糖尿病硫酸鋅組較鹽水組愈合面積更大， 創(chuàng)面組織微血管密度(MVD)相比更大(均P<0.05)；增殖性細胞核抗原(PCNA)陽性細胞在糖尿病硫酸鋅組較鹽水組表達增高(P<0.05)；糖尿病硫酸鋅組的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2在第5天和第10天時間點減少，且低于鹽水組(P<0.05)。糖尿病硫酸鋅組的基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)-1 mRNA含量在第5天和第10天時約為鹽水組的2倍，15 d時下降低于鹽水組(P<0.05)。 結論 硫酸鋅對于糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面具有良好的促進愈合作用，其機制與創(chuàng)面MMPs表達和基質(zhì)重建有關。

糖尿病；硫酸鋅；傷口愈合；MMPs

由于代謝和微循環(huán)障礙的原因，很多糖尿病(DM)患者可同時合并多種皮膚疾病〔1〕，主要表現(xiàn)為皮膚一旦出現(xiàn)破潰后創(chuàng)面難以愈合、局部感染和糖尿病足等，而這些病變的發(fā)生與神經(jīng)病變、血管病變以及DM皮膚組織的創(chuàng)面愈合能力低下等因素有密切關系。創(chuàng)傷愈合是多因素參與的病理生理過程，主要分為止血、炎癥、增殖和塑形4個階段〔2〕。除了炎癥細胞、修復細胞、多種細胞因子、微量元素外，細胞外基質(zhì)共同參與此過程。任何一個環(huán)節(jié)的調(diào)控異常均可導致創(chuàng)面愈合延遲〔3〕。鋅是人體內(nèi)重要的微量元素之一，是維持人體各種酶系統(tǒng)的必需成分。鋅不僅作為酶的輔助因子參與糖、蛋白質(zhì)代謝，同時還參與某些酶的激活〔4〕。當機體鋅缺乏時，會出現(xiàn)皮膚黏膜損傷的愈合延遲，說明鋅能夠促進皮膚及組織損傷的生長和促進傷口愈合。此外還有數(shù)據(jù)表明，鋅能夠拮抗氧化應激、穩(wěn)定抗氧化酶活性，在清除氧自由基的過程中發(fā)揮重要作用。鋅缺乏導致抗氧化酶的抗氧化能力下降，從而導致機體內(nèi)氧化應激增加〔5〕。筆者擬探討硫酸鋅對糖尿病皮膚損傷修復的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 鏈脲佐菌素(STZ)和硫酸鋅購于美國Sigma公司，Trizol試劑盒及cDNA合成試劑購于美國Life公司，增殖性細胞核抗原(PCNA)和CD34抗體購于北京博奧森生物技術公司，SP試劑盒和DAB顯色劑購于福州邁新公司，熒光定量qPCR試劑盒購于北京博奧生物公司。

1.2 動物 Wistar大鼠96只，雄性，體重180～220 g，由吉林大學基礎醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.3 DM大鼠模型的建立 實驗組：以50 mg/kg STZ行腹腔一次性注射。注射72 h，尾靜脈取血，測血糖。出現(xiàn)多飲、多食、多尿現(xiàn)象者，且血糖>16.7 mmol/L確定為DM大鼠。成模大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，每周稱量體重，隔周檢測血糖，持續(xù)監(jiān)測8 w。非DM組大鼠用等量枸櫞酸-枸櫞酸鈉液注射。

1.4 皮膚創(chuàng)傷模型的建立與分組 大鼠成模1個月之后，采用2.5%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)進行腹腔注射麻醉，脊背去毛，無菌條件下切除面積為9 cm2(直徑約3.4 cm)圓形皮膚，切口深度達皮下組織全層。為避免感染，大鼠單籠飼養(yǎng)。大鼠隨機分為鋅處理組(DM/Zn組)、鹽水對照組(DM/SA組)、非糖尿病組(NDM組)、非糖尿病鋅組(NDM/Zn組)。每組24只。

1.5 免疫組織化學 在創(chuàng)傷后5、10、15 d時間點，每組分別處死8只大鼠。取少許周圍正常組織和創(chuàng)面肉芽組織，固定，包埋。石蠟切片制成厚度為3 μm的切片，4℃條件下保存?zhèn)溆谩２捎肧P試劑盒并按說明操作：切片水化后，0.01 mol/L 的PBS洗滌3 min×3；然后置于檸檬酸緩沖液中92℃～95℃保溫20 min，在室溫條件下自然冷卻至37℃；加入50 μl 3%的H2O2室溫下孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化酶。PBS洗滌3 min×3；加50 μl 5%山羊血清，室溫下孵育10 min；切片滴加50 μl抗體PCNA 或CD34(免抗-CD34，兔抗-PCNA)；4℃孵育過夜。PBS沖洗3 min×3次，加50 μl生物素標記的二抗，室溫孵育10 min，PBS洗，3 min×3次；然后滴加50 μl 鏈霉菌抗生物素-過氧化酶溶液，室溫孵育10 min，PBS洗，3 min×3；加入DAB溶液顯色，蘇木精復染，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。設有PBS(代替一抗)的陰性對照。結果判定采用KS400圖像分析系統(tǒng)(德國Kaiser公司)分析。

1.6 數(shù)據(jù)分析 顯微圖像采集及分析創(chuàng)面微血管密度(MVD)計數(shù)：采用抗CD34抗體標記皮膚切片組織中的血管內(nèi)皮細胞，以孤立的棕黃色血管內(nèi)皮細胞或細胞簇為1條單獨的微血管，參考Pareek等〔6〕的計數(shù)方法進行計數(shù)，取平均值。創(chuàng)面愈合面積百分比計算：采用Adobe Image Ready7.0和Osiris軟件進行面積計算。在傷后24 h進行創(chuàng)面面積第1次測量為初始創(chuàng)傷面積；于取材時測量各時相點創(chuàng)面面積，愈合面積=初始創(chuàng)面面積-各時相點面積。創(chuàng)面愈合面積百分比=愈合面積/初始創(chuàng)面面積×100%。創(chuàng)緣局部PCNA的表達測定采取KS400圖像分析系統(tǒng)(德國Kaiser公司)分析：切片置于光學顯微鏡低倍鏡下觀察，以細胞核呈現(xiàn)明確的棕黃色顆粒狀染色為陽性細胞，細胞核藍染的細胞為蘇木精復染的陰性細胞，隨機在鏡下選擇均勻視野，計數(shù)100個細胞中陽性細胞所占的比例。

1.7 實時qPCR檢測基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)-1在轉(zhuǎn)錄水平的變化 通過Trizol法提取皮膚組織中的總RNA，從提取得到的總RNA中取10 μl進行逆轉(zhuǎn)錄。得到的cDNA產(chǎn)物，使用晶芯RT-Cycler實時熒光定量PCR儀進行PCR擴增，引物序列：MMP-2上游引物5′-ACC ATC GCC CAT CAT CAA GT-3′，下游引物5′-CGA GCA AAA GCA TCA TCC AC-3′；MMP-9，上游引物5′-AGT TTG GTG TCG CGG AGC AC-3′，下游引物5′-TAC ATG AGC GCT TCC GGC AC-3′；TIMP-1上游引物 5′-CCA CCT TAT ACC AGC GTT ATG-3′，下游引物5′-GGC AAA GTG ATC GCT CTG-3′；內(nèi)參β-actin上游引物5′-ACCACAGCTGAGAGGGAAATCG-3′，下游引物5′-AGAGGTCTTTACGGATGTCAACG-3′ 。擴增程序：預變性95℃、10 min；94℃、1 min，60℃、30 s，72℃、50 s， 40個循環(huán)；每個循環(huán)在延伸75℃時讀板，收集熒光值。得到的結果以β-actin基因作為內(nèi)參照，計算PCR產(chǎn)物相對量。mRNA的相對表達根據(jù)公式Fold change=2-ΔΔCt,ΔCt = Ct(target)- Ct(β-actin),Δ(ΔCt)=ΔCt(treated)-ΔCt(untreated)。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS11.0軟件做單因素方差分析。

2 結 果

2.1 各組大鼠干預治療前后愈合能力的比較 損傷后15 d，DM組大鼠皮膚創(chuàng)面大部分尚未愈合，非DM組大鼠皮膚創(chuàng)面已基本愈合。定量分析愈合面積，在損傷后5、10、15 d，創(chuàng)面愈合面積百分比顯著減少(P<0.05)，表明DM大鼠創(chuàng)面存在難以愈合及愈合延遲的現(xiàn)象。在15 d，硫酸鋅處理組的愈合率明顯高于鹽水組(P<0.05)。正常大鼠皮膚創(chuàng)面應用硫酸鋅處理與未處理組無明顯差別(P>0.05)。見表1。

2.2 免疫組化PCNA、CD34陽性細胞的表達 CD34和PCNA主要表達在皮膚創(chuàng)面組織的間質(zhì)細胞和毛細血管內(nèi)皮細胞，DM/Zn組CD34表達陽性細胞數(shù)量與DM/SA組比較明顯增加(見圖1)。DM組大鼠皮膚創(chuàng)面MVD值在傷后5、10和15 d均明顯低于非DM組(P<0.05)；第15天時，鋅處理組與鹽水組MVD值相比較更多(P<0.05)。見表2。在DM/Zn組中PCNA的表達陽性細胞數(shù)增多，與DM/Zn組相比具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。正常大鼠皮膚創(chuàng)面應用硫酸鋅處理與未處理組無明顯差別(P>0.05)。見表3。

組別5d10d15dDM/Zn組11.48±3.5138.73±6.101)2)59.05±8.601)2)DM/SA組11.31±2.6133.24±5.1748.78±8.56NDM/Zn組28.98±6.0574.34±8.5086.88±9.30NDM組27.64±5.6472.15±10.9985.45±7.53

與DM/SA組比較：1)P<0.05；與5 d比較：2)P<0.05；下表同

組別5d10d15dDM/Zn組8.00±2.0011.67±1.531)2)15.33±1.531)2)DM/SA組5.67±1.157.67±0.589.67±0.58NDM/Zn組13.86±3.2026.88±2.9620.86±1.02NDM組12.00±2.6524.00±2.0021.00±1.00

圖1 CD34和PCNA在DM大鼠皮膚損傷創(chuàng)面組織中的表達(Bar=50 μm)

2.3 DM皮膚缺損愈合過程中MMP-2、MMP-9及TIMP-1基因轉(zhuǎn)錄水平的變化 非DM組中第5天時，MMP-2和MMP-9轉(zhuǎn)錄增強，10 d時下降，至第15天時顯著下降；TIMP-1在第5天和第10天保持恒定，第15天顯著下降。DM/Zn組的MMP-2在第5天和第10天保持恒定，第15天顯著下降；MMP-9在第5天、第10天時呈現(xiàn)逐漸增加趨勢，而至第15天時則顯著減少，低于DM/SA組(P<0.05)。DM/Zn組的TIMP-1 mRNA含量在第5天和第10天時約為DM/SA組的2倍，15 d時下降低于DM/SA組(P<0.05)。見圖2～圖4。

圖2 MMP-2 mRNA在大鼠皮膚創(chuàng)面組織的表達變化

圖3 MMP-9 mRNA在大鼠皮膚創(chuàng)面組織的表達變化

圖4 TIMP-1 mRNA在大鼠皮膚創(chuàng)面組織的表達變化

3 討 論

創(chuàng)面愈合是一個錯綜復雜的生物學過程〔7〕，對于皮膚創(chuàng)面的愈合過程影響最大的主要有三方面：血管病變、神經(jīng)病變和高血糖所導致的氧化應激，其中任何一個環(huán)節(jié)的協(xié)調(diào)不穩(wěn)定均可以導致創(chuàng)面愈合的延遲。

微量元素鋅不僅能夠參與脂質(zhì)和蛋白質(zhì)代謝酶的輔助因子，同時鋅也是許多葡萄糖代謝酶的構成部分，在能量代謝過程中起重要作用。鋅在胰島素中含量很高，能夠增強胰島素穩(wěn)定性，鋅還能在受體水平調(diào)控胰島素信號轉(zhuǎn)導，增強降血糖作用〔8〕。Miranda等〔9〕發(fā)現(xiàn)鋅通過增強胰島素受體的酪氨酸磷酸化過程，使葡萄糖攝取與利用明顯增加；同時，鋅具有一定的類胰島素樣活性，在不依賴于胰島素的條件下，鋅同樣可使胰島素受體發(fā)生酪氨酸磷酸化。本研究表明，硫酸鋅可部分降低血糖濃度。

有研究表明，鋅作為清除氧自由基過程中的重要因子，能夠維持抗氧化酶穩(wěn)定性〔10〕。Soinio等〔11〕的臨床研究顯示，血清中與含鋅水平正常的DM患者相比較，含鋅水平較低的DM患者患心血管疾病的風險要更高，而且單獨補鋅對于含鋅水平較低的DM患者提高血清中含鋅水平，控制血糖水平有顯著效果。金屬硫蛋白(MT)是一種重要的內(nèi)源性細胞保護蛋白，具有清除氧自由基的作用，是體內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)。Tang等〔12〕將MT siRNA沉默的心肌細胞用鋅處理與對照組的抗氧化能力并無顯著差別，表明鋅的抗氧化作用是通過其誘導產(chǎn)生的金屬硫蛋白實現(xiàn)，而不是依靠鋅本身實現(xiàn)的。本研究結果表明，硫酸鋅外用可促進局部細胞增殖和微血管增生，對糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面具有良好的促進愈合作用。

以往研究證明，MMP/TIMP的動態(tài)平衡在創(chuàng)口愈合的過程中對控制創(chuàng)傷修復的結局至關重要。TIMPs作為MMPs的抑制因子，能有效抑制MMPs誘導的細胞外基質(zhì)降解，進而調(diào)控基質(zhì)重塑和促進新生血管生成。TIMPs的不足可導致創(chuàng)面遷延不愈或慢性的傷口形成〔13〕。本研究顯示，鋅可能通過調(diào)控皮膚創(chuàng)面局部組織的MMP/TIMP的表達變化參與皮膚損傷修復。

盡管目前鋅促進DM患者創(chuàng)面愈合的機制仍不明，但是本實驗以及前人的結果證實，作為人體必需的微量元素，鋅對DM患者創(chuàng)傷愈合具有非常重要的意義。

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〔2016-09-28修回〕

(編輯 曲 莉)

國家自然科學基金(81300660);吉林省發(fā)改委(2013C029-3);吉林省(白求恩專項)自然科學基金(20160101035JC)

1 吉林大學第一醫(yī)院內(nèi)分泌科

郭蔚瑩(1974-)，女，副教授，主要從事內(nèi)分泌代謝學研究。

張海峰(1975-)，男，副教授，主要從事介入治療學研究。

R587

A

1005-9202(2016)23-5777-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.004