益腎化濁方對阿爾茨海默病大鼠Bcl-2/Bax及α分泌酶蛋白可溶性淀粉酶前體蛋白α表達的影響

徐家淳 王 凱 覃啟京 宋宛珊 孫偉明 郭 威 張玉蓮

(天津中醫(yī)藥大學，天津 300193)

?

·基礎研究·

益腎化濁方對阿爾茨海默病大鼠Bcl-2/Bax及α分泌酶蛋白可溶性淀粉酶前體蛋白α表達的影響

徐家淳 王 凱1覃啟京1宋宛珊1孫偉明1郭 威1張玉蓮

(天津中醫(yī)藥大學，天津 300193)

目的 探討益腎化濁方對阿爾茨海默病(AD)模型大鼠可溶性淀粉酶前體蛋白α(sAPPα)、α 分泌酶蛋白以及Bcl-2/Bax比值的影響。方法 將30只雄性SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、益腎化濁方組，每組10只。益腎化濁方組灌以中藥，假手術組與模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，1次/d，共4 w。治療后取海馬標本并采用Western印跡檢測大鼠海馬中sAPPα、α分泌酶以及Bcl-2/Bax比值的表達。結果 與假手術組比較，模型組sAPPα、α分泌酶蛋白、Bcl-2/Bax比值表達明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，益腎化濁方組sAPPα、α分泌酶蛋白、Bcl-2/Bax比值明顯升高(P<0.05)。結論 益腎化濁方可通過促進Bcl-2表達、抑制Bax表達提高Bcl-2/Bax比值，上調(diào)AD模型大鼠海馬中sAPPα、α分泌酶蛋白，發(fā)揮抑制神經(jīng)細胞凋亡、抑制Aβ的神經(jīng)毒性作用。

益腎化濁方；阿爾茨海默病；Bcl-2/Bax；可溶性淀粉酶前體蛋白α；α分泌酶蛋白

β淀粉樣蛋白(Aβ)是阿爾茨海默病(AD)病程發(fā)展的使動因素〔1〕，而細胞凋亡是導致AD神經(jīng)細胞變性的重要病理機制〔2〕。AD的發(fā)生發(fā)展具有隱匿性和不可逆性，隨著人口老齡化的快速發(fā)展，AD 已成為一種嚴重危及老年人生命的疾病。本課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，益腎化濁方可顯著改善輕度AD 患者癥狀，并對認知功能及日常生活能力有一定的改善作用〔3〕，其機制可能與改善突觸形態(tài)學、調(diào)節(jié)Ca2+信號通路〔4〕、促進海馬區(qū)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)及其受體TrkB 蛋白的表達有關〔5〕，從而修復神經(jīng)元損傷。在此基礎上，本實驗擬通過觀察益腎化濁方對AD模型大鼠可溶性淀粉酶前體蛋白α(sAPPα)、α 分泌酶蛋白以及Bcl-2/Bax比值的影響，補充探討益腎化濁方治療AD的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 30只雄性SD大鼠(SPF級)，體重約200 g，購自北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部，合格證號SCXK(京)2011-0012)，隨機分為假手術組、模型組、益腎化濁方組，每組10只。采用大鼠右側腦室注射聚集態(tài)的Aβ片段25～35(Aβ25～35)制備AD模型〔5〕。益腎化濁方組灌胃劑量按照文獻〔6〕為4.32 g·kg-1·d-1，假手術組與模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，1次/d，共4 w。

1.2 藥物及試劑

1.2.1 益腎化濁方 益腎化濁方組成：淫羊藿10 g、女貞子10 g、肉蓯蓉10 g、川芎6 g、石菖蒲6 g、制首烏6 g。上述藥物共48 g，一次性購于天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，由天津中醫(yī)藥大學制劑中心制備，藥液置于4℃冰箱保存。

1.2.2 其他試劑 Aβ25～35(Sigma公司)，Bcl-2抗體(Santa Cruz生物技術公司)，Bax抗體、sAPPα抗體、α分泌酶抗體(abcam公司)。

1.3 蛋白定量檢測 將大鼠斷頸處死，冰上取海馬標本，裂解提取總蛋白，測定蛋白濃度，采用Western印跡檢測sAPPα、α分泌酶以及Bcl-2/Bax蛋白的表達。圖像結果采用 Image J 軟件分析。

2 結 果

2.1 益腎化濁方對Bcl-2/Bax的影響 與假手術組(1.66±0.26)比較，模型組Bcl-2/Bax比值(0.61±0.08)明顯降低(P<0.05)，與模型組相比，益腎化濁方組Bcl-2/Bax比值(1.10±0.05)明顯升高(P<0.05)。見圖1。

圖1 益腎化濁方對Bcl-2/Bax的影響

2.2 海馬區(qū)α分泌酶、sAPPα蛋白的表達結果 與假手術組(均為1)比較，模型組大鼠海馬區(qū)sAPPα(0.07±0.01)、α分泌酶蛋白(0.31±0.03)表達顯著下降(P<0.05)；與模型組相比，益腎化濁方組大鼠海馬區(qū)sAPPα(0.56±0.08)、α分泌酶蛋白(0.56±0.02)表達明顯升高(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組大鼠海馬區(qū)α分泌酶蛋白、sAPPα表達

3 討 論

本課題組前期證候學研究發(fā)現(xiàn)腎精虧虛、痰瘀阻竅是AD的常見證型〔7〕，因此，本課題組采用益腎化濁湯補腎益髓、化痰祛瘀，可有效改善輕度AD患者認知功能。方中女貞子補益肝腎，淫羊藿溫助腎精，石菖蒲、川芎共達化濁通絡之效。方中中藥有效成分淫羊藿苷可減少Aβ毒性，減輕大鼠海馬淀粉樣蛋白斑沉積，且可有效改善認知狀態(tài)〔8〕；β細辛醚可通過拮抗Aβ的神經(jīng)毒性改善學習記憶障礙〔9〕；川芎嗪可有效提高AD模型小鼠學習和記憶能力〔10〕；齊墩果酸可通過下調(diào)JAK/STAT通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用〔11〕；且本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)益腎化濁方可有效改善AD大鼠學習記憶能力〔4〕，但其作用機制尚待進一步研究。

凋亡是AD發(fā)展中神經(jīng)細胞的主要死亡方式，而Bcl-2蛋白家族對調(diào)控凋亡過程有重要作用〔12〕。Bcl-2蛋白家族有兩類，即Bcl-2和Bax，兩者在功能上相互拮抗，Bcl-2抑制細胞凋亡；而Bax促進凋亡，而且還可抑制Bcl-2的抗凋亡作用，兩者的比例是發(fā)生凋亡的關鍵因素〔13〕。因此，促進Bcl-2蛋白表達、同時抑制Bax蛋白的表達、提高Bcl-2/Bax比值，可阻止細胞凋亡。本實驗表明益腎化濁中藥可促進Bcl-2表達、抑制Bax表達，有效減少神經(jīng)細胞凋亡。

連續(xù)沉積的Aβ具有神經(jīng)毒性，可引發(fā)突觸異變、Tau蛋白異常磷酸化等病變，對神經(jīng)元功能造成損傷，是AD的重要病理基礎〔14〕。Aβ 是淀粉樣前體蛋白(APP)經(jīng)過淀粉樣代謝途徑(β、γ分泌酶)產(chǎn)生的，APP 經(jīng)過非淀粉樣代謝途徑(α、γ分泌酶)產(chǎn)生可溶性片段sAPPα，sAPPα具有神經(jīng)營養(yǎng)和保護作用，能競爭性減少Aβ 的產(chǎn)生，從而延緩AD 的發(fā)展〔15〕。目前β、γ 分泌酶抑制劑的研究進展并不順利，而激活α 分泌酶是一種治療AD 的新靶點〔16〕。本實驗結果顯示益腎化濁方可上調(diào)AD模型大鼠海馬中sAPPα、α分泌酶蛋白的表達量，該過程可減少Aβ的生成，從而抑制其神經(jīng)毒性作用，延緩AD的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，益腎化濁方可通過促進Bcl-2表達、抑制Bax表達提高Bcl-2/Bax比值，上調(diào)AD模型大鼠海馬中sAPPα、α分泌酶蛋白，發(fā)揮抑制神經(jīng)細胞凋亡、抑制Aβ的神經(jīng)毒性作用，部分補充了益腎化濁方改善AD癥狀的作用機制。

1 Voevodskaya O，Sundgren PC，Strandberg O，etal.Myo-inositol changes precede amyloid pathology and relate to APOE genotype in Alzheimer disease〔J〕.Neurology，2016；86(19)：1754-61.

2 AliMohammadi M，Eshraghian M，Zarindast MR，etal.Effects of creatine supplementation on learning，memory retrieval，and apoptosis in an experimental animal model of Alzheimer disease〔J〕.Med J Islam Repub Iran，2015；29：273.

3 Zhang Y，Lin C，Zhang L，etal.Cognitive improvement during treatment for mild Alzheimer′s disease with a Chinese herbal formula：a randomized controlled trial〔J〕.PLoS One，2015；10(6)：e130353.

4 張玉蓮，崔遠武，周 震，等.益腎化濁方對SAMP8小鼠學習記憶能力及海馬神經(jīng)元突觸關鍵蛋白CREB的影響〔J〕.中醫(yī)雜志，2014；55(22)：1942-6.

5 王 凱，張琳琳，宋宛珊，等.益腎化濁方對阿爾茨海默病模型大鼠海馬區(qū)BDNF及其受體TrkB蛋白表達的影響〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2015；21(5)：111-4.

6 徐叔云，卞如濂，陳 修.藥理實驗方法學〔M〕.第3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：202-3.

7 張玉蓮，張連城，李 強，等.660例老年性癡呆患者中醫(yī)證候學研究〔J〕.中醫(yī)雜志，2015；56(3)：235-9.

8 Zhang L，Shen C，Chu J，etal.Icariin decreases the expression of APP and BACE-1 and reduces the β-amyloid burden in an APP transgenic mouse model of Alzheimer′s disease〔J〕.Int J Biol Sci，2014；10(2)：181-91.

9 Liu J,Li C,Xing G,etal.Beta-asarone attenuates neuronal apoptosis induced by beta amyloid in rat hippocampus〔J〕.Yakugaku Zasshi，2010；130(5)：737-46.

10 Kim M，Kim SO，Lee M，etal.Tetramethylpyrazine，a natural alkaloid，attenuates pro-inflammatory mediators induced by amyloid β and interferon-γ in rat brain microglia〔J〕.Eur J Pharmacol，2014；740(5)：504-11.

11 Zhang YL，Zhou Z，Han WW，etal.Oleanolic acid inhibiting the differentiation of neural stem cells into astrocyte by down-regulating JAK/STAT signaling pathway〔J〕.Am J Chin Med，2016；44(1)：103-17.

12 Shan M，F(xiàn)an TJ.Cytotoxicity of carteolol to human corneal epithelial cells by inducing apoptosis via triggering the Bcl-2 family protein-mediated mitochondrial pro-apoptotic pathway〔J〕.Toxicol In Vitro，2016;35(1):36-42.

13 Meichner K，F(xiàn)ogle JE，English L，etal.Expression of apoptosis-regulating proteins bcl-2 and bax in lymph node aspirates from dogs with lymphoma〔J〕.J Vet Intern Med，2016；30(3)：819-26.

14 Karthick C，Periyasamy S，Jayachandran KS，etal.Intrahippocampal administration of ibotenic acid induced cholinergic dysfunction via NR2A/NR2B expression：implications of resveratrol against Alzheimer disease pathophysiology〔J〕.Front Mol Neurosci，2016；9(1)：28.

15 Jimenez S，Torres M，Vizuete M，etal.Age-dependent accumulation of soluble amyloid beta (Abeta)oligomers reverses the neuroprotective effect of soluble amyloid precursor protein-alpha (sAPP(alpha))by modulating phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt-GSK-3beta pathway in Alzheimer mouse model〔J〕.J Biol Chem，2011；286(21)：18414-25.

16 Futai E，Osawa S，Cai T，etal.Suppressor mutations for presenilin 1 familial Alzheimer disease mutants modulate gamma-secretase activities〔J〕.J Biol Chem，2016；291(1)：435-46.

〔2016-03-17修回〕

(編輯 袁左鳴)

Influence of Yishen Huazhuo decoction on the expressions of sAPPα, α-secretase protein, and Bcl-2/Bax of AD rats

XU Jia-Chun, WANG Kai, QIN Qi-Jing,et al.

Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China

Objective To observe the influence of Yishen Huazhuo Decoction(YHD)on soluble amylase precursor protein α (sAPPα), α-secretase protein, and Bcl-2/Bax of AD rats.Methods 30 male SD rats were randomly divided into sham, model, YHD groups, 10 in each group. Rats in YHD group were fed with Chinese medicine, and rats in sham and model groups were fed with normal saline, once daily for 4 weeks. After treatment, hippocampus were detected by Western blot, to observe the expressions of sAPPα, α-secretase enzyme, and Bcl-2/Bax.Results Compared with those of sham group, the expressions of sAPPα, α-secretase protein, Bcl-2/Bax ratio of model group were significantly reduced(P<0.05). Compared with those of model group, the expressions of sAPPα, α-secretase protein, and Bcl-2/Bax of YHD group were significantly higher(P<0.05).Conclusions YHD could promote the expression of Bcl-2, and inhibit Bax expression to increase Bcl-2/Bax ratio; and increase the expressions of sAPPα, α-secretase protein, to play the role of inhibiting neuronal apoptosis, and neurotoxic effects of Aβ.

Yishen Huazhuo decoction(YHD); Alzheimer′s disease; Bcl-2/Bax; Soluble amylase precursor protein α; α-secretase

國家自然科學基金項目(81273940，81473490)

1 天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院

張玉蓮(1963-)，女，博士生導師，主要從事中醫(yī)內(nèi)科腦病研究。

徐家淳(1989-)，男，在讀博士，主要從事中醫(yī)內(nèi)科腦病研究。

R28

A

1005-9202(2016)23-5769-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.001