滋陰明目丸對大鼠視網膜光損傷后細胞凋亡的影響

胡敏娜，羅萍，顏家朝，李傳課，李波，龍達

·論著：實驗研究·

滋陰明目丸對大鼠視網膜光損傷后細胞凋亡的影響

胡敏娜1，羅萍2，顏家朝2，李傳課2，李波2，龍達2

目的觀察滋陰明目丸對Sprague-Dawley（SD）大鼠視網膜光損傷后視細胞凋亡的影響。方法SD大鼠60只，采用隨機數字表法分為空白對照組、模型對照組、陽性對照組、滋陰明目丸低劑量組、滋陰明目丸中劑量組、滋陰明目丸高劑量組，每組10只。除空白對照組外，其余5組大鼠均建立視網膜光損傷模型，光損傷處理后3 d開始灌胃給藥。滋陰明目丸低、中、高劑量組予滋陰明目丸，劑量分別相當于成人1/3倍（2.6 g/kg，0.052g/ml）、成人等效劑量（7.8 g/kg，0.156 g/ml）、成人3倍劑量（23.4 g/kg，0.46 g/ml），陽性對照組予杞菊地黃丸成人等效劑量（1.62 g/kg，0.081 g/ml），空白對照組及模型對照組予生理鹽水。各組給藥15 d后處死，制作視網膜石蠟切片，TUNEL染色，光學顯微鏡觀察計算視細胞凋亡指數（AI）。結果空白對照組的AI值為1.5439%±1.5154%，模型對照組AI值遠高于空白對照組（P＜0.01），為63.3077%±4.7531%。低劑量組AI值60.8298±5.9315%，與模型對照組數值接近（P=0.095）；中、高劑量組及陽性對照組AI值明顯低于模型對照組（P值均＜0.01），數值分別23.2864%±7.0224%，22.5674%±5.8763%，23.0666%±5.5213%，該三組間兩兩比較，差異均無統計學意義（中劑量組與高劑量組比較，P=0.639；中劑量組與陽性對照組比較，P=0.886；高劑量組與陽性對照組比較，P=0.733）。結論一定劑量的滋陰明目丸可以抑制光損傷模型大鼠的視細胞凋亡，對光損傷后大鼠的視細胞具有一定的保護作用。

細胞凋亡；視網膜光損傷；滋陰明目丸

隨著社會經濟的發展，人們在生活的方方面面與光源密不可分，與損傷性光源的接觸也越來越頻繁，環境和人造光源都可能是潛在危險因素〔1〕。近年來，對視網膜光損傷的損傷防御機制及防治的研究成為普遍關注的問題，流行病學研究發現視網膜光損傷與視網膜色素變性、年齡相關性黃斑變性等疾病有關〔2〕。國內外大量臨床基礎研究表明，細胞凋亡是視網膜細胞光損傷的主要表現形式之一〔3〕。本實驗擬通過建立大鼠視網膜光損傷模型，觀察滋陰明目丸對視網膜光損傷后凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物選取6～8周齡健康Sprague-Dawley（SD）大鼠（雌雄不論，湖南斯萊克實驗動物有限公司提供，SPF級）60只，每只體質量150～180 g左右。采用隨機數字表法分為6組，每組10只，分別為空白對照組、模型對照組、陽性對照組、滋陰明目丸低劑量組（低劑量組）、滋陰明目丸中劑量組（中劑量組）、滋陰明目丸高劑量組（高劑量組）。所有實驗大鼠均在12 h明（20～50 lx）以及12 h暗（0～12 lx）的循環光環境下適應10 d。

1.1.2實驗用藥滋陰明目丸（湘藥制字Z20080745，規格120 g/瓶），湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科提供。主要藥物組成：熟地黃、黃精、枸杞子、菟絲子、山茱萸、山藥、茯苓、楮實子、牡丹皮、三七、丹參、牛膝、當歸、石決明、川芎、羌活、石菖蒲等。杞菊地黃丸（批號201310038，長沙九芝堂集團有限公司），湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科提供，主要藥物組成：枸杞子、菊花、熟地黃、山茱萸、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉等。復方托吡卡胺滴眼液（美多麗，規格10 ml，批號M484351，日本參天制藥），湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科提供。滋陰明目丸和杞菊地黃丸均按比例制備成混懸液。

1.1.3主要儀器及試劑TSAI-8720型數字照度計（蘇州特安斯電子有限公司）；羅氏公司凋亡試劑盒（貨號：11684817910）。

1.2實驗方法

1.2.1視網膜光損傷模型制作自制光照箱作為光損傷裝置，箱體規格1 m×35 cm×35 cm，箱內垂直4個面和箱底分別安裝4根15 W的白色熒光燈管，燈管內側放置玻璃隔板，上方安裝多個排風孔。光照箱中心向各方向的平均照度為（1 900±106.9）lx，相當于大鼠眼球水平正?；顒訒r各箱壁的照度為2000lx，光照箱內的平均溫度維持在22～24℃。除空白對照組外，其余組SD大鼠造模前暗適應24 h后均置于乙醚麻醉缸中吸入麻醉約5 min，縫線開瞼，并予復方托吡卡胺滴眼液行雙眼散瞳處理后，接受3 h持續光照射。光照后立即拆除開瞼縫線，送回暗環境中，之后均在12 h明及12 h暗的循環光環境下生活。

1.2.2分組給藥造模動物在前述光損傷處理后3d開始給藥。根據體表面積計算法，計算出相當于成人的等效治療量。低劑量組予以滋陰明目丸相當于成人的1/3倍劑量2.6g/kg的混懸液（0.052 g/ml）、中劑量組予成人等效劑量7.8 g/kg的混懸液（0.156 g/ml）、高劑量組予以成人3倍劑量23.4g/kg的混懸液（0.46g/ml）灌胃，陽性對照組予杞菊地黃丸成人等效劑量1.62g/kg的混懸液（0.081 g/ml）灌胃，空白對照組及模型對照組同期予以生理鹽水（與成人劑量等容）灌胃。每天上下午分別灌胃1次，每次劑量是全日量的1/2。灌胃后15 d處死大鼠，取眼球送檢。

1.2.3制作石蠟切片（1）4%多聚甲醛固定24 h，去掉眼前節及玻璃體，固定大鼠視網膜。（2）組織按常規進行固定、脫水、浸蠟、石蠟包埋。每只眼球經視盤顳上方旁開1 mm縱向切片，切片厚度4 μm。

1.2.4TUNEL法染色（1）石蠟切片脫蠟至水。（2）加蛋白酶K工作液做酶修復，室溫孵育15 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）（pH=7.4）洗3次，每次5 min。（3）加破膜工作液常溫下孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min。按片子數量和組織大小取適量試劑1（TdT）：試劑2（dUTP）=1∶9混合，加到組織上，37℃水浴鍋孵育60 min，濕盒內加少量水保持濕度。（4）PBS沖洗3次，每次5 min，組織上加入3%新鮮配制的甲醇雙氧水，常溫避光孵育15 min。（5）PBS沖洗3次，每次5 min。甩去PBS液，每張切片加適量試劑3（converter-POD），37℃水浴鍋孵育30 min。PBS洗3次，每次5 min。（6）甩去PBS液，每張切片加50～100 μl新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡控制顯色。（7）顯色完全后，蒸餾水或自來水沖洗，蘇木素復染，1%鹽酸乙醇分化（1 s），自來水洗，氨水返藍，自來水洗，鏡下觀察。（8）切片經過兩道100%乙醇，每道5～10 min，脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.2.5光學顯微鏡觀察視細胞凋亡指數（AI）光學顯微鏡下觀察經TUNEL法標記的凋亡視細胞的切片，切片上的組織為一細長條帶，選取這條帶的橫截中線，在高倍鏡（×400）下隨機觀察中線附近10個視野，計算出這10個視野的總面積和這10個視野內凋亡視細胞的總數，將這一總數作為每張切片的視細胞凋亡數，取5張連續切片視細胞凋亡數的均數作為該眼的視細胞凋亡數，取每只大鼠兩眼球視細胞凋亡數的均數作為該大鼠的視細胞凋亡數，用該大鼠的視細胞凋亡數除以10個高倍鏡視野的總面積即為該大鼠的視細胞凋亡指數（AI）。

1.3統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件分析所有數據，計量資料都采用均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1石蠟切片TUNEL法標記光學顯微鏡觀察

空白對照組，外核層無細胞核被標記（圖1A）。模型對照組，SD大鼠視網膜外核層中有陽性細胞核被標記。被標記的陽性細胞核呈棕黃色，核著色不均勻，細胞膜完整，染色質邊聚成“新月形核”或“環形核”，核染色質濃縮在中央形成“眼球形核”（圖1B）。低劑量組，SD大鼠視網膜外核層中被標記的細胞核減少（圖1C）。中、高劑量組及陽性對照組，外核層中被標記的細胞核明顯減少，但三組間并無明顯組織病理學差異（圖1D～圖1F）。

2.2視細胞凋亡指數（AI）

模型對照組的AI值遠高于空白對照組（63.3077%＞1.5439%，P＜0.01），低劑量組AI值略低于模型對照組，但二者差異無統計學意義（P=0.095）；中、高劑量組及陽性對照組AI值明顯低于模型對照組（P值均＜0.01），該三組間兩兩比較，差異均無統計學意義（中劑量組與高劑量組比較，P=0.639；中劑量組與陽性對照組比較，P=0.886；高劑量組與陽性對照組比較，P=0.733）（表1）。

表1 各組大鼠視網膜視細胞凋亡指數比較（x±s）

圖1 各組大鼠視網膜石蠟切片光學顯微鏡像（TUNEL法標記，×400）。1A.空白對照組，外核層未見細胞核標記；1B.模型對照組，外核層可見陽性細胞核（棕黃色）；1C.滋陰明目丸低劑量組，外核層陽性細胞較模型對照組減少；1D.滋陰明目丸中劑量組，外核層陽性細胞較模型對照組明顯減少；1E.滋陰明目丸高劑量組，外核層陽性細胞較模型對照組明顯減少；1F.陽性對照組，外核層陽性細胞較模型對照組明顯減少

3 討論

視網膜是人體產生視覺的重要器官，也極易受到內外致病因素的影響。過強的光照或長時間直視光源會對視網膜造成損害。光化學損傷是導致視網膜光損傷最主要的損傷因素，光感受器細胞的死亡途徑有三種，分別是凋亡、壞死和自噬，其中，凋亡是主要途徑〔4〕。細胞凋亡，又被稱為程序性細胞死亡，是指在體內外因素誘導下，由基因嚴格調控而發生的自主性細胞有序死亡，是生物體內普遍存在的一種不同于壞死的生理調節性的細胞死亡，具有特殊的形態學改變。凋亡蛋白酶（Caspase）是白介素-1轉化酶樣蛋白酶，為線蟲死亡基因CED-3在哺乳動物中的對應產物。大量研究表明，Caspase可成為細胞進入程序性死亡的特異性標志，凋亡的主要通路分別是Caspase依賴型細胞凋亡通路和Caspase非依賴型細胞凋亡通路。Caspase依據結構和功能的不同，可分為三類：Caspase2，8，9，10為起始凋亡蛋白酶〔5〕；Caspase3，6，7為效應凋亡蛋白酶〔6，7〕；Caspase1，4，5為與炎癥相關的凋亡蛋白酶〔8〕。Caspase依賴型凋亡通路主要是起始凋亡蛋白酶和效應凋亡蛋白酶參與，Caspase非依賴型凋亡通路主要以鈣蛋白酶或組織蛋白酶介導為主。

中國古代對光損害性眼病即有描述，唐代孫思邈的《備急千金要方》云：“數看日月、夜視星火……并是喪明之本”；《外臺秘要》中也提到“數向日月輪看”“雪山巨晴視日”都是“喪明之由”。又根據其“目內外無癥候，但自視昏渺矇眛不清”（《審視瑤函》）的臨床表現，將其歸于“視瞻昏渺”范疇?！蹲C治準繩·雜病·七竅門》指出此癥：“有勞神，有血少，有元氣弱，有元精虧而昏渺者?！备伍_竅于目，肝受血而能視，腎精充足，上榮于目，則視物清晰。持續的光損害，易傷陰耗血，目竅失養，久之肝腎同虧，精血不足，血運不暢，瘀血阻滯。因此我們認為此類眼病的病機與肝腎陰虛，目絡瘀滯有關，中醫治法可予以滋陰活血之劑。

杞菊地黃丸出自《醫級·卷八》，由六味地黃丸加枸杞子、菊花而成，功效為補益肝腎，主治肝腎虧虛，常用于干眼、屈光不正及年齡相關性白內障、年齡相關性黃斑變性等眼底疾病，是眼科的常用方。滋陰明目丸是李傳課教授根據數十年的臨床經驗總結而成，臨床應用多年。在提高視力、擴大視野、消散瘀血、改善功能、減輕癥狀等方面獲得了較好療效。此方主要由熟地黃、黃精、枸杞子、菟絲子、山茱萸、山藥、茯苓、楮實子、牡丹皮、三七、丹參、牛膝、當歸、石決明、川芎、羌活、石菖蒲等藥物組成，方中熟地黃滋補肝腎、填精益髓為君；枸杞子、菟絲子、山藥、茯苓、楮實子、黃精、山茱萸為臣，協助君藥補腎養陰、益肝明目；牡丹皮、三七、丹參、牛膝、當歸止血養血、活血化瘀；石決明平肝除障為佐；羌活辛散防滯，引藥上行；石菖蒲開竅宣通為使。諸藥合用，共奏滋補肝腎，活血化瘀名目之功。本實驗通過建立視網膜光損傷模型，使用光學顯微鏡觀察視細胞凋亡指數，研究顯示一定劑量的滋陰明目丸可以抑制光損傷模型大鼠的視細胞凋亡，對光損傷后大鼠的視細胞具有一定的保護作用。但由于視網膜光損傷機制較復雜，光感受器細胞凋亡不是單一因素或某一環節導致，仍需進一步研究。此外，滋陰明目丸是中藥制劑，其成分的多樣性，作用的多向性導致藥理作用的研究欠完善，因此僅以此探討該藥的作用機制稍顯不足，有待在今后的研究中進一步完善。

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Effect of Ziyin Mingmu pill on apoptosis of retinal damage in rats

HU Minna,LUO Ping,YAN Jiazhao,et al.Hunan University of Traditional Chinese Medicine,Changsha 410007,China

OBJECTIVETo observe effect of Ziyin Mingmu pill on optic cell apoptosis after retinal light injury in Sprague-Dawley(SD)rat.METHODSA total of 60 SD rats were randomly divided into control group, model control group,positive control group as well as low dose,medium dose and high dose of Ziyin Mingmu pill groups,which meant 10 rats in each group.Except control group,rats it the other 5 groups were made into model of retinal light injury,3 days after light injury medication began by gastric.Low,medium and high dose of Ziyin Mingmu pills were equivalent to 1/3 of adult dose(2.6 g/kg,0.052g/ml),the human equivalent dose(7.8 g/kg,0.156 g/ml),tripple adult dosage(23.4 g/kg,0.46g/ml)respectively,positive control group was treated with Qiju Dihuang pill with adult equivalent dose(1.62g/kg.0.081g/ml),blank control group and model control group were given saline. Fifteen days after medication,rats of each group were sacrificed,while the paraffin sections of the retina were made, and TUNEL staining was used to observe the apoptotic index(AI).RESULTSCompared with blank control group, AI of model control group was significant high(63.3077%±4.7531%VS 63.3077%±4.7531%,P<0.001);AI of low dose group was 60.8298±5.9315%which was similar to that of model control group;AI of middle,high dose group and positive control group were all obviously lower than model control group(P<0.001);among these groups, comparisons between each two groups showed no difference at all.Specifically,P value of comparison between medium dose group and high dose group,medium dose group and positive control group,high dose group and positive control group were 0.639,0.886 and 0.733 respectively.CONCLUSIONSA certain dose of Ziyin Mingmu pillcould inhibit cell apoptosis in rat model of light damage,and it had a protective effect on retinal cells after light damage in rats.

apoptosis;retinal light damage;Ziyin Mingmu pill

R285.5

：A

：1002-4379（2016）04-0211-04

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2016.04.001

國家自然科學基金項目（81303007/H2713）；全國名老中醫藥專家李傳課傳承工作室[國中醫藥人教發2013（47）號]

1.湖南中醫藥大學，長沙410208；

2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，長沙410007

羅萍，E-mail：1216718845@qq.com