基于HS-SPME/GC-MS和感官分析技術的單菌發酵對咖啡果酒風味影響研究

胡榮鎖，周晶，董文江，陸敏泉，宗迎

（1中國熱帶農業科學院香料飲料研究所；海南萬寧571533；2國家重要熱帶作物工程技術研究中心；海南萬寧571533；3中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所；海口571533）

基于HS-SPME/GC-MS和感官分析技術的單菌發酵對咖啡果酒風味影響研究

胡榮鎖1,2，周晶3，董文江1,2，陸敏泉1,2，宗迎1,2

（1中國熱帶農業科學院香料飲料研究所；海南萬寧571533；2國家重要熱帶作物工程技術研究中心；海南萬寧571533；3中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所；海口571533）

為探討單菌發酵對果酒風味的影響，利用GC-MS分析對風味影響的物質基礎，利用電子感官（電子鼻和電子舌）和人為感官判定菌種對咖啡果酒整體風味的影響，研究結果為釀造優質風味咖啡果酒篩選最佳菌種組合提供理論參考。實驗結果表明，4種酵母中B和D釀成的果酒中乙醇的相對含量高于其他2種，C損失略高于其他3種酵母。GC-MS分析共檢出化合物26種，其中酯類15種、醇類7種、其他化合物4種；所檢化合物除酸類物質外，均具有令人愉悅的風味；醇類均為高級醇，主要是異戊醇和苯乙醇；酵母D峰面積明顯高于其他3種，而醇酯比C(8.61)＞A(4.17)＞B(1.16)＞D(1.05)。電子感官檢測發現，電子鼻和電子舌的第1主成分的貢獻率均達到98%以上，但大多存在交叉，區分效果較差，說明風味和口感較為接近；人為感官區分結果與電子感官結果一致。

咖啡；果酒；風味；電子感官

0 引言

中國咖啡種植面積已超過12萬hm2，年產咖啡果皮40萬t。目前咖啡果皮除少量作為肥料還田外，其余大量堆積廢棄；既是對資源的浪費，也對當地生態環境造成不良的影響。

國內對咖啡果皮的綜合利用研究較少，研究不深，如石磊等[1]報道咖啡果肉可用于牲畜飼料，對其生長性能具有一定的促進作用；利美蓮等利用種咖啡干果皮為原料發酵生產咖啡果酒，取得了良好的風味口感[2]，在此基礎上對其生產工藝進行優化處理，取得了較好的效果[3]；韓洪波等[4]建立了一種咖啡果皮咖啡因的測定方法，其測定咖啡因含量為1.79%。而國外在咖啡果皮（包含果肉）的綜合利用研究主要集中在成分檢測、動物飼料和生物利用方面。成分檢測方面主要檢測了咖啡果皮中的多酚、咖啡因和單寧成分[5-6]。動物飼料研究主要是利用生物技術處理咖啡果皮和果肉，增強營養成分，更加適合生物喂養，且具有改善肉質的作用[7-10]；而在生物利用方面主要是在產酶[11]、生物乙醇[12]和沼氣[13]的應用；在咖啡果酒生產應用尚未見報道。

本項目是在響應面優化發酵條件的基礎上，研究4種酵母單菌發酵果酒風味差異，為選擇最佳發酵菌種或最佳菌種組合提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗材料為云南小粒種咖啡果皮，收集自云南省普洱市，由云南農業大學熱帶作物學院協助收集。纖維素酶為Celluclast 1.5 L，自黑曲霉(Aspergillus niger)中提取，購自諾維信公司(Novozymes)公司，果膠酶購自南寧龐博生物工程有限公司，釀酒酵母購自中國工業微生物菌種保藏管理中心，編號依次為A—1425、B—1557、C—1793、D—32762，正構烷烴(C7～C30)購自美國Supelco公司，亞硫酸氫鈉（分析純）、蔗糖（市售級）、麥芽汁培養基粉、0.45 nm有機相膜等，釀造用水為超純水。

SPME手動進樣手柄及萃取頭（纖維頭），上海安譜科學儀器有限公司；7890A-5975C氣相色譜質譜聯用儀，美國Agilent公司；HS-100型自動進樣器，瑞士CTC公司；α-Astree型電子舌味覺分析系統，法國Alpha.MOS公司；α-Genemi型電子鼻，法國Alpha. MOS公司；Z36HK型超速冷凍離心機，德國Hermle公司，LE 438型pH計，瑞士Mettler-Toledo公司。

實驗時間為2015年4—6月，在中國熱帶農業科學院香料飲料研究所綜合實驗樓完成。

1.2 實驗方法

1.2.1 咖啡果酒釀造方法準確稱取咖啡果皮5 g，裝入250 mL三角瓶中，加入纖維素酶3 mL，50℃下酶解3 h，加入白砂糖22.5 g、亞硫酸氫鈉0.008 g（發酵液中SO2濃度約為35 mg/L），自然pH，1×105Pa滅菌20 min，冷卻后接入對數期菌種2 mL，28℃120 r/min搖床發酵3天，發酵結束后發酵液9000 r/min離心10 min。

1.2.2 咖啡果酒產品指標測定酒精含量測定采用蒸餾法；糖含量測定采用手持糖量計；酸度測定采用pH計。

1.2.3 咖啡果酒香氣成分檢測方法

（1）SPME前處理。取2 mL發酵好的咖啡果酒（按0.3 g/mL加氯化鈉），放入20 mL的頂空瓶中，50℃下預熱20 min，插入萃取頭吸附30 min，將萃取頭插入氣相色譜進樣口，250℃解吸附5 min。

（2）氣質條件。初始溫為50℃，保持5min，以5℃/min升溫至240℃，然后以1℃/min升溫到250℃。載氣為氦氣；流量為1.0 mL/min。離子源為EI源模式．電子轟擊能量70 eV，離子源溫度為230℃，接口溫度280℃，掃描范圍30～350 amu。色譜庫NIST 08。積分開始時間為5.00 min，以避免溶劑峰[14]。

1.2.4 咖啡果酒感官檢測方法

（1）電子舌檢測方法。樣品處理：取離心后發酵液樣品20 mL加入150 mL樣品杯，添加超純水60 mL。檢測條件：清洗時間10 s；攪動速度1 r/s；采集溫度25℃；采集時間210 s；傳感器類型：ZZ、BA、CA、HA、GA、BB、JB，重復8次[15]。

（2）電子鼻檢測方法。樣品處理：取發酵液10 mL倒入9 cm平板，加入有機相液相過濾膜12份（每張平均分成4份），蓋上平板蓋，靜置放置3 h，取其中2份加入10 mL樣品瓶密封。檢測條件：采用頂空進樣；載氣為空氣；流速150 mL/min；進樣量1500μL；采集延遲210 s；孵化期300 s；溫度80℃；注射器溫度90℃，重復4次[15]。

（3）人為感官檢測方法。檢測指標參考咖啡杯品指標，設定風味、香味、后味、甜度、酒度、酸度、清潔度和平衡度共8個指標。檢測人員由產品加工專業人員組成方法，4男3女組成評判小組，檢測數值求平均值。

1.2.5統計學方法使用主成分分析來表達電子舌和電子鼻檢測結果。

2 結果與分析

2.1 酶解糖化效果分析

使用纖維素酶和果膠酶將咖啡果皮進行酶解，通過糖量計進行檢測，同時將檢測溫度修正為標準溫度下白利糖度，然后轉化為百分比濃度，以求咖啡果皮轉化糖的含量，進而求轉化率。由表1可知，咖啡果皮轉化率均達到68%以上，Murthy[16]的研究表明，咖啡果皮中纖維素63.0%、果膠17.5%，即纖維素和果膠占總含量的80.5%，由此可知本實驗中纖維素酶果膠酶糖化降解率達到85%以上，酶解糖化效果良好。

2.2 菌種對咖啡果酒發酵效果分析

為測定菌種發酵效果，以發酵前后糖度、酸度、產生的酒精量及發酵過程中糖損失率為指標進行評判，具體結果見表2。

由表2可知，4種釀酒酵母發酵后糖度、酸度均有所下降，下降后各指標差異較小，理論酒精度和實際酒精度之間存在差異較大，可知在發酵過程中糖存在損失，其中C酵母損失最多，達到2.49%。糖損失可能是使用搖床發酵造成的。釀酒酵母在發酵過程有2條轉化途徑，在厭氧條件下產生乙醇，在有氧條件下產生二氧化碳和水，在搖床過程中雖然增加了釀酒酵母和糖的接觸率，加快了反應速率，但也使發酵液中氧含量增加。

2.3 發酵菌種對果酒風味組分差異分析

使用峰面積歸一化法確定咖啡果酒風味化合物的含量，對化合物的鑒定采用與NIST 08質譜庫對比，結合人工檢索，確定其化學組成；同時由于使用的是DBWAX色譜柱未檢索到相關的保留指數，因此本實驗中僅有正構烷烴確定的線性保留指數。化合物風味描述部分借鑒馮愛軍等[17]和范文來等[18]的研究成果，其他組分風味描述來自網絡。

表3表明，咖啡果酒中共檢出化合物26種，其中酯類15種、醇類7種，其他化合物如醛類、酸類和酮類共4種。從風味描述可以看出，所檢化合物除酸類物質外，均具有令人愉悅的風味。由于積分是從5 min開始，甲醇和乙醇未檢出；所檢醇類均為高級醇，主要是異戊醇和苯乙醇，該高級醇組成與劉曉艷等[19]研制柿子酒中高級醇組成一致。

表1 纖維素酶果膠酶酶解糖化效果分析

表2 菌種對咖啡果酒發酵效果分析

各菌種化合物、峰面積及醇酯比分析結果見表4，可見各菌種化合物數量差異不明顯，醇類和酯類為主要化合物；峰面積部分差異顯著，含量最多的為D，其次為A，酵母B和C峰面積含量幾乎一致。

醇酯比是指高級醇和總酯的比值。高級醇和酯類物質是果酒風味物質的重要組成部分。醇酯比過高則酒味過濃，香味不足；醇酯比過低則香味過濃，酒味不足，則失去果酒本身意義，因此本實驗將醇酯比作為一項重要指標。果酒中醇酯比范圍目前尚未有統一標準，但在啤酒中孟艷麗[20]認為醇酯比(3～5):1，酒體具有風味比較協調、柔和。在本實驗中酵母C醇酯比最高為8.61，其次為酵母A為4.17，酵母B和D醇酯比較為相似在1.0～1.5。

表3 不同菌種釀造果酒風味差異性分析

表4 不同酵母風味分析結果比較

2.4 發酵菌種對果酒感官評價差異分析

2.4.1 人為感官評價差異分析咖啡果酒感官指標借鑒咖啡杯品，分別從香味、風味等8個指標對咖啡果酒進行打分，得分結果見圖1。從圖1可以看出，各菌種發酵的果酒均具有獨特的優勢，如酵母C在平衡度、清潔度、甜度和風味；酵母A在香味、后味和酸度，酵母B在甜度、香味和清潔度，酵母D在清潔度均具有較高的得分，但同時也具有各自的缺點，酵母C發酵果酒整體得分最高。

2.4.2 電子感官評價差異分析PCA分析是在樣品特性未知的前提下，通過變換觀察視角來尋找樣品間差異的一種算法。該算法不丟失任何樣品信息，僅通過改變坐標軸來達到區分樣品的目的[21]。對A、B、C和D酵母發酵果酒進行電子感官（電子舌和電子鼻）PCA分析，整體判斷各發酵果酒在風味和口感上的差異，分析結果見圖2～3。從圖2～3可以看出，各發酵果酒第1主成分的貢獻率均達到98%以上，說明不同菌種發酵果酒的差異主要體現在第1主成分上。同時發現各菌種發酵果酒雖相對集中但存在交叉現象，區分效果較差，區分指數不高，說明各菌種發酵果酒在風味和口感上存在差異小。而圖3中酵母D發酵果酒與其他3種存在顯著差異，說明該果酒與其他3種在口感上相差較大，該結果與人為感官較為一致。

圖1 各菌種發酵果酒感官評價結果圖

圖2 不同菌種發酵果酒電子鼻PCA分析圖

3 結論與討論

（1）果酒、白酒等酒制品風味檢測存在多種檢測方式，最常用的是液液萃取、固相微萃取，此外還有液相微萃取，如姜自軍等[22]。在固相微萃取中對萃取頭的選擇同樣存在多種方式，如蘇海榮[23]、張斌等[24]選擇100μm PDMS萃取頭，劉曉艷等[19]、馮愛軍[17]選擇使用75μm CAR/PDMS萃取頭，李美萍等[25]使用50/30μm DVB/CAR/PDMS，而張巧珍[26]等則認為65μm PDMS/ DVB萃取頭最佳。不同萃取頭對咖啡果酒風味組分的選擇性吸收有一定的偏好性，對本研究而言，咖啡果酒中主要是酯類和醇類物質，其次還有醛類和酸類等，該系列組分一般極性都偏強，根據極性和揮發性，75μm CAR/PDMS萃取頭較為適合本研究。

圖3 不同菌種發酵果酒電子舌PCA分析圖

（2）在感官分析中電子感官（電子舌和電子鼻）PCA分析中各果酒相互交叉，區分度較差，整體風味較為接近；人為感官中同樣發現各果酒不存在較大差異，但同時發現具有獨特的優勢和劣勢，因此下一步將進行混菌發酵，以確定最佳發酵組合，生產最佳咖啡果酒。

（3）本研究中以峰面積表示化合物含量，對化合物含量統計，此方法雖較為常用，但科學性欠佳。化合物水中閾值具有差異性，因此化合物含量高低并不一定表示香味濃郁與否，應用內標法定量表示化合物含量，且與閾值對比，確定強度值。

[1]石磊.咖啡加工副產物在牲畜飼料中的應用[J].中國畜牧獸醫文摘,2014(9):195-196.

[2]利美蓮,鐘秋平.不同氣溫條件下咖啡酒釀制的工藝研究[J].食品工業,1994(6):28-30.

[3]利美蓮,梁志海,潘曉暢.利用咖啡果皮釀酒初報[J].熱帶作物學報, 1989(1):25-30.

[4]韓洪波,楊春琳,李敏杰.HPLC測定小粒種咖啡不同部位咖啡因含量[J].食品研究與開發,2013(6):85-88.

[5]Clifford M N.Tannins in wet-processed coffee beans and coffee pulp[J].Food Chemistry,1991,40(2):191-200.

[6]Clifford M N,Ramirez-Martinez J R.Phenols and caffeine in wetprocessed coffee beans and coffee pulp[J].Food Chemistry,1991,40 (21):35-42.

[7]Orozco A L,Pérez M I,Guevara O.Biotechnological enhancement ofcoffeepulpresiduesbysolid-statefermentationwith Streptomyces.Py–GC/MS analysis[J].Journal of Analytical and Applied Pyrolysis,2008,81(2):247-252.

[8]Ulloa Rojas J B,Verreth J A J,Amato S,et al.Biological treatments affect the chemical composition of coffee pulp[J].Bioresource Technology,2003,89(3):267-274.

[9]DulceSalmones,GerardoMata,KrzysztofNWaliszewski. Comparative culturing of Pleurotus spp.on coffee pulp and wheat straw:biomassproductionandsubstratebiodegradation[J]. Bioresource Technology,2005,96(5):537-544.

[10]Salinas-Rios T,Ortega-Cerrilla M.E,Sánchez-Torres-Esqueda M T. Productive performance and oxidative status of sheep fed diets supplemented with coffee pulp[J].Small Ruminant Research,2015, 23(1):17-21.

[11]Roopali N,Bhoite,Pushpa S.Murthy.Biodegradation of coffee pulp tannin by Penicillium verrucosumfor production of tannase, statistical optimization and its application[J].Food and Bioproducts Processing,2015,94:727-735.

[12]Deepa Shenoy,Anjali Pai,R.K.Vikas.A study on bioethanol production from cashew apple pulp and coffee pulp waste[J]. Biomass and Bioenergy,2011,35(10):4107-4111.

[13]Grisel Corro,Laura Paniagua,Umapada Pal.Generation of biogas from coffee-pulp and cow-dung co-digestion:Infrared studies of postcombustion emissions[J].Energy Conversion and Management, 2013,74:471-481.

[14]胡榮鎖,初眾,吳桂蘋,等.基于GC-MS的咖啡不易揮發性風味物質研磨逸散性研究[J].熱帶農業科學,2011,31(10):95-100.

[15]胡榮鎖,陸敏泉,吳桂蘋,等.基于電子舌的咖啡不同干燥模式判別[J].食品工業科技,2014,35(1):304-306,317.

[16]Murthy Pushpa S,Naidu M Madhava.Sustainable management of coffee industry by-products and value addition-A review[J]. Resources,Conservation and Recycling,2012 66:45-58.

[17]馮愛軍.廣東客家娘酒中風味物質研究[D].福州:福建農林大學, 2011:27-32.

[18]范文來,徐巖.酒類風味化學[M].北京:中國輕工業出版社,2014.

[19]劉曉艷,白衛東,沈穎,等.混菌發酵對柿子酒風味的影響研究[J],中國釀造,2012,31(9):102-106.

[20]孟艷麗,李文華,李永娟.啤酒醇酯比分析綜述[J],啤酒科技,2014 (1):11-13.

[21]Laura Maeztu,Cristina Sanz,Susana Andueza.Characterization of Espresso Coffee Aroma by Static Headspace GC-MS and Sensory Flavor Profile[J].Agric Food Chem,2001,49:5437-5444.

[22]姜自軍,閻雪,單紀平,等.頂空液相微萃取/氣相色譜-質譜檢測葡萄酒的風味組分[J].現代食品科技,2011,27(9):1137-1142.

[23]蘇海榮.黃酒中揮發性風味物質的研究[D].青島:青島科技大學, 2013:27-52.

[24]張斌,曾新安,陳勇,等.添加谷氨酸對荔枝酒香氣成分的影響[J].食品與機械,2008,24(1):32-40.

[25]李美萍,苗瀟瀟,張生萬.HS-SPME-GC-MS分析石榴酒中易揮發性成分[J].食品科學,2014,35(8):263-268.

[26]張巧珍,肖冬光.不同萃取頭對荔枝酒香氣成分分析的比較[J].天津科技大學學報,2010,25(5):21-26.

Flavor Impact of Single Strain Ferment on Coffee Wine Based on HS-SPME/GC-MS and Sensory Analysis Technology

Hu Rongsuo1,2,Zhou Jing3,Dong Wenjiang1,2,Lu Minquan1,2,Zong Ying1,2

(1Spice and Beverage Research Institute,CATAS,Wanning 571533,Hainan,China;2National Center of Important Tropical Crops Engineering and Technology Research,Wanning 571533,Hainan,China3Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology,CATAS,Haikou 571533,Hainan,China)

The aim of this paper was to investigate the effects of single stain fermentation on coffee wine flavor. The gas chromatography-mass spectrometer(GC-MS)was utilized to analyze the coffee wine flavor compounds of stain fermentation,and electronic sensory(e-nose and e-tongue)and human sensory were utilized to evaluate the overall flavor effect of coffee wine.The study provided a theoretical reference for brewing highquality coffee flavor wine and selecting the optimum strain combination.The experimental results showed that the ethanol value of the yeast B and D brewed coffee wine was higher than the others,while the loss rate of the yeast C brewed coffee wine was slightly higher than the other three kinds of yeast.The GC-MS detected 26 compounds,including 15 esters,7 alcohols,and 4 other compounds.The detected compounds were in addition to the acids,had a pleasant flavor.The alcohol compounds all were higher alcohols,mainly 3-methyl-1-butanol and phenylethyl alcohol.The peak area of yeast D was significantly higher than that of the other three kinds of yeast;the alcohol ester ratio was C(8.61)＞A(4.17)＞B(1.16)＞D(1.05).Electronic sensory testingshowed that the first principal component analysis contribution rate of electronic nose and electronic tongue was more than 98%,but most regions were overlapped and had the poor distinguish effect,indicating that the coffee wine brewed with the four kinds of Saccharomyces cerevisiaes had close flavor and taste.Human sensory distinguishing had the same result.

Coffee;Fruit Wine;Flavor;Electronic Senses

S-3

A論文編號：cjas15070011

中國熱帶農業科學院院本級基本科研業務費專項資金“發酵菌種對咖啡果酒風味影響研究”(1630052015043)。

胡榮鎖，男，1982年出生，山東濟寧人，碩士，研究方向為熱帶作物加工。通信地址：571533海南省萬寧市興隆鎮香料飲料研究所，Tel：0898-62556090，E-mail：hnhrs@126.com。

陸敏泉，男，1972年出生，副研究員。通信地址：571533海南省萬寧市興隆鎮香料飲料研究所，Tel：0898-62556090，E-mail：lmq663@126.com。

2015-07-20，修回日期：2015-09-25。