pH對吲哚美辛理化性質和離體透皮參數的影響Δ

張永萍，徐 劍，吳靜瀾，謝偉杰（貴陽中醫學院藥學院，貴陽 550002）

pH對吲哚美辛理化性質和離體透皮參數的影響Δ

張永萍＊，徐 劍#，吳靜瀾，謝偉杰（貴陽中醫學院藥學院，貴陽 550002）

目的：研究不同pH對吲哚美辛理化性質和離體透皮參數的影響。方法：采用高效液相色譜法進行定量分析，測定pH分別為5.0、5.8、6.5、7.3、8.0下吲哚美辛的溶解度、表觀油水分配系數（Kapp）和吲哚美辛凝膠的離體透皮參數[滲透速率（Js）和4、12、24 h累積滲透量（Q4h、Q12h、Q24h）]，通過復相關分析法與回歸模型確定pH、溶解度、Kapp與離體透皮參數的相關性。結果：吲哚美辛凝膠離體透皮模型符合零級動力學模型，pH與溶解度、Kapp具有良好線性模型（r≥0.892 0），相關性良好（r≥0.968 0）；pH、溶解度、Kapp與離體透皮參數之間基本呈指數模型，以pH 7.3為調節臨界點的對應Kapp為3.34。結論：調節pH，可改善吲哚美辛的溶解度與Kapp；調節分子-離子存在形式，可提高吲哚美辛的Q和Js。

pH；吲哚美辛；理化性質；離體透皮參數；相關性

吲哚美辛（Indomethacin），屬于吲哚類生物堿，略顯酸性，按生物藥劑學分類系統（BCS）劃分屬于第二類，高滲透性低溶解性；作為非甾體抗炎、解熱、鎮痛藥，其抗炎、解熱作用明顯，常用于治療風濕性關節炎；但口服給藥具有嚴重的胃腸道不良反應，存在神經副作用、致腎損傷等問題[1-2]。為了減小其毒副作用，對其經皮給藥方法的研究較多。基于此，本文研究了pH對吲哚美辛理化性質與離體透皮參數的影響，以期為新型吲哚美辛親水凝膠貼劑的經皮給藥開發研究奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；TK-12B型透皮擴散儀（上海鍇凱科技貿易有限公司）；TGL-16B型臺式離心機（上海安亭科學儀器廠，離心半徑：6.0 cm）。

1.2 藥品與試劑

吲哚美辛對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100258-200904，純度：99.9%）；吲哚美辛原料藥（上海源葉生物科技有限公司，批號：YY-10944，純度：99.5%）；苯扎溴銨（江西德成制藥有限公司，醫用級，批號：20111016）；甲醇為色譜純，磷酸為優級純，正辛醇、硫化鈉及其他試劑均為分析純。

1.3 動物

昆明種小鼠，SPF級，體質量為18～25 g，♀♂兼用，由第三軍醫大學實驗動物中心提供，合格證號為SCXK（軍）2012-0011。

2 方法與結果

2.1 色譜條件[3-5]

色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸水（80∶20，V/V），流速：1 ml/min；可變波長檢測器（VWD檢測器），檢測波長：228 nm；柱溫：35℃；進樣量：10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 緩沖液 參考2015年版《中國藥典》（四部）通則8003項[6]，制備pH分別為5.0、5.8、6.5、7.3、8.0的磷酸鹽緩沖液（PBS），室溫靜置，貯存，備用。

2.2.2 對照品溶液 精密稱取吲哚美辛對照品適量，用pH為7.3的PBS溶解后定容，制備成57.80 μg/ml的吲哚美辛標準品溶液，根據需要再稀釋至不同濃度。

2.2.3 供試品溶液 取離體透皮接收液，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液作為供試品溶液。

2.2.4 陰性樣品溶液 取空白凝膠（不含吲哚美辛）的離體透皮接收液，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液作為陰性樣品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗 取供試品溶液、對照品溶液、陰性樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜。

2.3.2 線性關系考察 取吲哚美辛對照品制備成5.78、8.67、11.56、17.34、23.12、28.9、34.68、46.24、57.80 μg/ml的標準品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以質量濃度（x）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標，繪制標準曲線。

2.3.3 精密度、穩定性、重復性與加樣回收率試驗 取對照品與供試品，分別按相關規定考察儀器精密度、24 h樣品穩定性、重復性和加樣回收率。

2.4 溶解度的測定

參考2015年版《中國藥典》（四部）凡例中“溶解度試驗法”[3]操作。精密稱取過量吲哚美辛原料藥，置于50 ml量瓶中，加入不同pH（5.0、5.8、6.5、7.3、8.0）的PBS，在（25±2）℃下電熱恒溫振蕩水槽勻速振蕩4 h，當觀察到底部溶質有部分不溶物且不再減少時，認為已被飽和溶解；室溫條件靜置2 h后，取上清液2 ml，12 000 r/min離心12 min，經0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液作為供試品。

2.5 表觀油水分配系數（Kapp）的測定

采用“搖瓶法”[4-6]。制備不同pH（5.0、5.8、6.5、7.3、8.0）的含吲哚美辛飽和溶解的PBS，飽和質量濃度為c0。分別精密取10 ml含吲哚美辛飽和溶解的PBS，再加入等體積被水飽和的正辛醇，密封口。在（25±2）℃下勻速振蕩24 h，兩相平衡，靜置4 h，取下層含吲哚美辛的PBS 2 ml，12 000 r/min離心12 min，經0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液作為供試品。檢測其中吲哚美辛的質量濃度c水，計算Kapp，Kapp＝（c0－c水）/c水。

2.6 離體透皮試驗

2.6.1 離體皮膚制備與保存 取小鼠脫毛，脫頸部處死，剝取腹部皮膚，去除皮下脂肪、血管等附屬組織，置于1‰苯扎溴銨溶液（新潔爾滅）中浸泡30 min防腐，取出后生理鹽水沖洗，加入適量20%甘油，剪成適當大小，密封袋包裝，－20℃冷凍保存。

2.6.2 吲哚美辛凝膠制備[7]以明膠2.805 g、聚乙烯醇4.353 g、羧甲基纖維素鈉2.504 g、甘油14.871 g、氧化鋅0.139 g作為凝膠基質，分別加不同pH的PBS至100 g，制得載藥量均為12.5 mg的不同pH的吲哚美辛凝膠。

2.6.3 累積滲透量（Q）的測定 采用Franz裝置[8]，接收池體積7.0 ml，接觸面積2.92 cm2，不同pH（5.0、5.8、6.5、7.3、8.0）的PBS為接收液，每種接收液重復6次。將離體皮膚固定，剪去多余的邊緣，精密稱定2.0 g不同pH的吲哚美辛凝膠，緊貼于離體皮膚角質層和膜一側上面，確保無氣泡存在，頂端用塑料薄膜密封。設置水浴恒溫為（37±1）℃，轉速為300 r/min，分別于1、2、4、6、8、10、12、16、24 h精密取樣2 ml，同時補充相應pH的等溫等體積PBS，測定其中吲哚美辛的濃度，計算Q。Q＝，式中Q為單位面積累積滲透量（μg/cm2），V為接收池體積，A為接收池接觸面積，cn為第n個取樣點質量濃度，ci為第i個取樣點濃度，Vi為接收液體積。繪制離體透皮曲線，采用零級動力學模型對曲線進行擬合分析，其斜率即為滲透速率（Js）。

2.7 相關性分析[9-10]

以pH與吲哚美辛溶解度、pH與吲哚美辛Kapp、pH與吲哚美辛離體透皮參數作變化曲線圖，分析不同pH對吲哚美辛理化性質和離體透皮參數的影響。采用復相關性分析法對吲哚美辛溶解度、Kapp與pH相關性進行評價分析，采用Pearson復相關分析法對溶解度、Kapp、pH與離體透皮參數相關性進行評價分析。各數據分析均采用SPSS 19.0軟件。

2.8 回歸分析[11]

以pH為自變量（X）、溶解度與Kapp為因變量（Y），利用SPSS 19.0進行三者線性回歸模型分析。結合pH表示氫質子濃度的指數形式，對pH、溶解度、Kapp與離體透皮參數采用線性回歸模型分析，無實際統計學意義，故采用指數回歸模型進行擬合分析；分別以LN（pH）、IN（溶解度）、N（Kapp）為自變量（X），透皮參數IN（Q）為因變量（Y），采用逐步法進行回歸擬合。

3 結果

3.1 方法學考察結果

吲哚美辛的出峰時間約為8 min，陰性樣品對其測定無干擾；吲哚美辛的回歸方程為y＝23.594x+1.22（r＝0.999 6），檢測質量濃度的線性范圍為5.78～57.80 μg/ml；儀器精密度、24 h樣品穩定性與重復性試驗的峰面積RSD依次為0.23%、1.24%、2.57%（n＝6）；加樣回收率為99.8%，RSD＝0.18%（n＝6）。高效液相色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

3.2 溶出度與Kapp檢測結果

不同pH下吲哚美辛的溶解度和Kapp的檢測結果見表1。

表1 不同pH下吲哚美辛的溶解度和Kapp的檢測結果（n＝3）Tab 1 The solubility and Kappof indomethacin at different pH values（n＝3）

3.3 離體透皮參數檢測結果

24 h內吲哚美辛凝膠的離體透皮符合零級動力學模型，r≥0.992 0，屬于控釋釋放制劑。不同pH下吲哚美辛凝膠的離體透皮曲線見圖2，不同pH下吲哚美辛凝膠的離體透皮參數的檢測結果見表2。

圖2 不同pH下吲哚美辛凝膠的離體透皮曲線（n＝6）Fig 2 The transdermal curves of indomethacin at different pH values in vitro（n＝6）

表2 不同pH下吲哚美辛凝膠的離體透皮參數的檢測結果（n＝6）Tab 2 The transdermal parameters of indomethacin at different pH values in vitro（n＝6）

3.4 相關性分析結果

（1）當pH為5.0～8.0時，隨pH升高，吲哚美辛的溶解度呈一定指數曲線模型增加；當pH大于7.3后，溶解度的增加幅度（斜率）變大。pH與溶解度存在正向線性相關（r＝0.892 0）。（2）pH與Kapp存在負向線性相關（r＝－0.893 0）。（3）當pH為5.0～7.3時，隨pH升高，吲哚美辛凝膠的Js、Q4h、Q12h、Q24h均呈一定線性增加；當pH大于7.3后則逐漸減小，說明pH 7.3為吲哚美辛的pH調節臨界點，其對應的Kapp＝3.34。pH、Kapp與吲哚美辛凝膠離透皮參數存在良好相關性，其他參數相關性不顯著。不同pH下吲哚美辛溶解度、Kapp和吲哚美辛凝膠離體透皮參數變化的曲線見圖3。pH、溶解度、Kapp、離體透皮參數相關性分析結果見表3。

圖3 不同pH下吲哚美辛溶解度、Kapp和吲哚美辛凝膠離體透皮參數變化的曲線Fig 3 The curves for solubility and Kappof indomethacin and in vitro transdermal parameters of Indomethacin gel at different pH values

表3 pH、溶解度、Kapp、離體透皮參數相關性分析Tab 3 The correlation among pH，solubility，Kappand in vitro transdermal parameters

3.5 回歸分析結果

溶解度、Kapp與pH具有良好線性回歸模型，r≥0.892 0。各自變量與離體透皮參數間指數回歸模型擬合性基本良好，排除部分干擾因素，pH-溶解度、pH-Kapp、pH-Q24h、pH-Js、溶解度-Q24h、溶解度-Js均呈現較好指數關系模型，r≥0.8，P≤0.05。溶解度、Kapp與pH的線性回歸模型分析結果見表4，溶解度、Kapp、pH、離體透皮參數的線性回歸模型分析結果見表5。

表4 溶解度、Kapp與pH的線性回歸模型分析結果Tab 4 Analysis of regression model for solubility and Kappat different pH values

表5 溶解度、Kapp、pH、離體透皮參數的線性回歸模型分析結果Tab 5 Analysis of regression model for solubility，Kapp，pH and in vitro transdermal parameters

4 討論

BCS是基于藥物體外溶解性與腸道滲透性兩方面對藥物進行分類而形成的分類系統。除了皮膚屏障作用外，藥物自身理化性質，包括溶解性、分子態、晶型等，對透皮特性產生重要影響，此對應藥物的溶解性與跨膜轉運特性，可用于指導經皮給藥制劑設計。

由于吲哚美辛具有良好的脂溶性，幾乎不溶于水，且顯酸性，酸度系數為4.5。根據BCS，通過調節pH的手段改善吲哚美辛分子-離子存在形式，以改變其溶解度；根據Fick定律，提高透皮擴散皮膚兩側濃度差ΔC（即為dC/dx），可提高透皮動力，一定范圍內能提高吲哚美辛的透皮效果。但由于皮膚主要屏障結構（角質層），主要由類脂和角質蛋白類結構組成，屬于脂溶性，而吲哚美辛分子-離子形式本身具有更明顯的水溶性，會阻礙藥物透過角質層。因此，在溶解性與脂溶性兩者之間存在一個平衡界限，即提高藥物溶解性與保持藥物脂溶性之間平衡最佳值，以Kapp表示。本研究結果表明，吲哚美辛存在pH 7.3臨界值與Kapp為3.34，兩者恰相一致。

本研究回歸分析結果表明，指數模型基本可以用于預測分析pH、Kapp、溶解度與離體透皮參數間的變化趨勢。基于BCS，通過建立pH與Kapp、溶解度曲線、透皮參數之間數學模型關系，計算獲得最佳pH、Kapp，獲得酸堿性藥物最優透皮效果，即通過回歸模型計算獲得最佳pH、Kapp，再通過制劑手段改善藥物分子-離子存在形式，以提高藥物透皮吸收。

綜上，調節pH，可改善吲哚美辛的溶解度與Kapp；調節分子-離子存在形式，可提高吲哚美辛的Q和Js。

[1] 張青，徐群為，張靜，等.吲哚美辛固體分散體的制備和理化性質的研究[J].中國醫院藥學雜志，2007，27（9）：1 203.

[2] 趙曉軍.吲哚美辛乳膏的制備及體外透皮特性和藥效學研究[D].錦州：遼寧醫學院，2015：17-21.

[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：四部[S].2015年版.北京：中國醫藥科技出版社，2015：9.

[4] 熊耀坤，梁爽，杜焰，等.HPLC法測定洋川芎內酯Ⅰ的平衡溶解度和表觀油水分配系數[J].藥物分析雜志，2012，32（9）：1 644.

[5] 徐文，孫進，張婷婷，等.HPLC法測定冬凌草甲素平衡溶解度和表觀油水分配系數[J].沈陽藥科大學學報，2007，24（4）：220.

[6] 劉海燕，黃志軍，梁穎，等.常用透皮吸收促進劑對鹽酸西替利嗪經皮滲透性能的影響[J].中國藥房，2016，27（1）：41.

[7] 楊芳芳，孟憲生，張永萍，等.鹽酸川芎嗪水凝膠透皮貼劑的初步研究[J].遼寧中醫藥大學學報，2009，11（9）：176.

[8] 李璐，蔡麗娟，楊金榮，等.吲哚美辛巴布劑小鼠離體皮膚透皮吸收實驗研究[J].天津醫藥，2011，39（2）：165.

[9] 王曉麗，周宋匯.吲哚美辛理化性質的測定及研究pH對其經皮滲透活性的影響[J].中國現代藥物應用，2012，6（20）：117.

[10] 戴麗莉，葛朝倫，孫奇，等.中藥湯劑煎藥機加液量數學模型的初步研究[J].中國藥房，2016，27（1）：18.

[11] 俞吉，朱瑞，董妍君，等.骨疏靈顆粒不同配伍對淫羊藿苷含量的影響[J].中國藥房，2016，27（1）：79.

Effects of pH Value on Physicochemical Property and in vitro Transdermal Parameters of Indomethacin

ZHANG Yongping，XU Jian，WU Jinglan，XIE Weijie（School of Pharmacy，Guiyang College of TCM，Guiyang 550002，China）

OBJECTIVE：To study effects of different pH values on physicochemical property and in vitro transdermal parameters of indomethacin.METHODS：HPLC method was used for quantitative analysis；solubility，apparent partition coefficient（Kapp）and in vitro transdermal parameters[permeation rate（Js）and 4，12，24 h accumulative premeation amount（Q4h，Q12h，Q24h）]of Indomethacin gel were determined at pH 5.0，5.8，6.5，7.3，8.0.The multiple correlation analysis and regression model were used to determine the correlations of pH，solubility，Kappand transdermal parameters.RESULTS：Indomethacin gel in vitro transdermal model fully complied with zero-order kinetic model；and pH was good linear relationship with solubility and Kapp（r≥0.892 0），showing good correlation（r≥0.968 0）；the exponential model relationships were shown among pH，solubility，Kappand in vitro transdermal parameters；using pH 7.3 as the critical point，corresponding Kappwas equal to 3.34.CONCLUSIONS：Adjusting pH can improve the solubility and Kappof indomethacin；adjusting existing form of molecular ion can increase Q and Jsof indomethacin.

pH；Indomethacin；Physicochemical property；in vitro transdermal parameters；Correlation

R913

A

1001-0408（2016）34-4770-04

2016-02-26

2016-05-13）

（編輯：鄒麗娟）

貴州省高層次創新型人才培養項目（No.黔科合人才〔2015〕4030號）

＊教授，碩士生導師。研究方向：藥物新制劑與新劑型。E-mail：zgygpg@126.com

#通信作者：教授，碩士生導師。研究方向：藥物新制劑與新劑型。E-mail：twt8489@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.34.06