人臍帶間充質干細胞復合脫細胞軟骨細胞外基質取向支架修復山羊膝關節全層軟骨缺損的實驗研究

張雨，劉舒云，郭維民，郝春香，王明杰，苑志國，黃靖香，眭翔，張莉，盧世璧，郭全義

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人臍帶間充質干細胞復合脫細胞軟骨細胞外基質取向支架修復山羊膝關節全層軟骨缺損的實驗研究

張雨，劉舒云，郭維民，郝春香，王明杰，苑志國，黃靖香，眭翔，張莉，盧世璧，郭全義

目的 探索人臍帶間充質干細胞復合脫細胞軟骨細胞外基質取向支架構建組織工程軟骨，用于修復山羊膝關節負重區全層軟骨缺損的可行性。方法 從人臍帶中分離、擴增培養人臍帶間充質干細胞，并進行鑒定；以豬源脫細胞軟骨細胞外基質取向支架為組織工程軟骨支架載體；在成年山羊膝關節負重區股骨髁處造全層軟骨模型；實驗分為兩組，以人臍帶間充質干細胞復合脫細胞軟骨細胞外基質取向支架修復組為實驗組，單純全層軟骨缺損造模作為對照組，每組 3 只山羊。術后7 d、14 d 分別抽取關節液涂片行 H&E 染色，觀察炎癥反應。在術后 3、6 個月后分別處死兩組實驗動物，取材進行大體形態學觀察及評分、組織學染色及評分、軟骨特異性基質成分定量檢測。結果 ①關節液涂片 H&E 染色結果顯示，術后兩組膝關節炎癥反應未見明顯差異。②大體形態學觀察及組織學染色結果均證實，實驗組修復區再生的關節軟骨更加接近天然軟骨，且與周邊整合良好，獲得更好的修復效果。大體形態學及組織學評分均證實，實驗組的評分均要明顯高于對照組（< 0.05）；③糖胺多糖定量檢測結果顯示實驗組明顯高于對照組（< 0.05）。結論 人臍帶間充質干細胞復合脫細胞軟骨細胞外基質取向支架構建組織工程軟骨，可用于修復山羊膝關節負重區全層軟骨缺損，是未來治療軟骨損傷較有應用前景的方法之一。

充質干細胞； 細胞外基質； 組織支架； 組織工程； 軟骨，關節

關節軟骨在關節中發揮著重要的功能，如潤滑關節、緩沖振蕩及傳遞負荷等[1]。由于軟骨組織缺乏血管、神經的特殊性，導致其一旦損傷將不能自愈。往往伴隨著膝關節的腫脹、疼痛、功能障礙，極大地影響患者的身心健康和社會功能[2-3]，遠期不可避免地發生骨性關節炎。組織工程理念的提出給組織再生與修復帶來了新的希望，并展現了巨大的應用潛能。特別是軟骨組織工程方面，有望成為軟骨修復與再生最具有希望的策略之一。種子細胞和支架材料是軟骨組織工程中最為重要的部分，尋找一種便于臨床轉化的優良軟骨組織工程種子細胞，并復合適合種子細胞生長、分化的支架材料，用于構建組織工程軟骨更是當前軟骨組織工程研究的熱點之一。

軟骨組織工程最理想的種子細胞自然是來源于自體的軟骨細胞[4]，但是由于其來源受限且體外擴增易發生去分化，給患者帶來二次的軟骨損傷等缺點，于是尋找一種便于臨床轉化的優良軟骨組織工程種子細胞顯得尤其重要。近年來，來源于圍產期組織的人臍帶間充質干細胞因其具有獨特的優勢而受到廣泛的關注。前期的基礎研究證實，人臍帶間充質干細胞不但具有和成體間充質干細胞相似的多系分化潛能，還具有更好的細胞活性、增殖能力和極低的免疫原性等優點[5-6]。另外，由于其在孕婦生產后視為遺棄物，所以其來源更為廣泛，不會對患者造成二次損傷，無倫理爭議，更加利于臨床的轉化和應用。我們實驗室前期制備了豬源脫細胞軟骨細胞外基質取向支架，該支架一方面來源于軟骨組織，可以為種子細胞提供更加優良的生長、分化微環境；另一方面仿生天然軟骨的垂直取向結構，可以很好地引導種子細胞的取向性再生。前期的體內、外實驗均證實該支架具有良好的軟骨損傷修復效果。

本實驗在前期的研究基礎上，應用人臍帶間充質干細胞復合脫細胞軟骨細胞外取向支架構建的三維組織工程軟骨，探索其在山羊體內修復全層膝關節負重區軟骨缺損的可行性，旨在為未來的軟骨再生與修復提供一種具有希望和應用前景的組織工程軟骨修復策略。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 材料來源 于本院產科經患者知情同意后獲得足月產健康人臍帶適量。取本實驗室制備好的豬源脫細胞軟骨細胞外基質取向軟骨支架[7-8]，切為直徑與厚度分別為 6.5 mm 和1.5 mm大小，并進行60Co 消毒備用。

1.1.2 試劑 DMEM/F12 購自美國 Corning 公司；胰蛋白酶-EDTA 購自美國 Sigma 公司；CD45-PE 購自英國 Abcam 公司；速眠新 II 購自長春市軍需大學獸醫研究所；鹽酸丁卡因購自武漢大華偉業醫藥化工有限公司；組織糖胺多糖比色法定量檢測試劑盒購自上海杰美基因醫藥科技有限公司。

1.1.3 實驗動物 8 ~ 12 個月齡健康成年雄性普通山羊，體重 30 ~ 40 kg。大動物手術通過解放軍總醫院動物倫理委員會的論證。

1.2 實驗方法

1.2.1 人臍帶間充質干細胞的分離培養及鑒定獲取足月產產婦新鮮臍帶，經無菌處理及去除血液后，置于 DMEM/F12培養基培養皿中剔除動靜脈血管。培養基再次清洗數次，剪為 1 mm3大小組織塊，以適當的密度接種于直徑 15 cm 的培養皿中，加 5.0 ml DMEM/F12（含 10% 胎牛血清）培養基，置于 37 ℃，5% CO2飽和濕度的培養箱內培養。次日加入 10.0 ml 相同培養基，繼續培養3 ~ 5 d 更換培養基，10 ~ 14 d 后剔除組織塊。待細胞貼壁融合至 80% 時，用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化收集細胞，按 1:3 的比例傳代至第 3 代后，用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化收集細胞，每管加 100 μl 密度為 1 × 106/ml 的單細胞懸液，然后分別加入 CD29-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD14-PE、CD34-PE、CD45-PE 抗體各 10 μl，室溫避光孵育30 min，PBS 洗滌重懸，流式細胞儀上機檢測，Cell-Quest（Mac）軟件分析，每個樣本至少收獲20 000 個細胞。

1.2.2 人臍帶間充質干細胞復合脫細胞軟骨細胞外基質取向支架體外構建組織工程軟骨修復體 取第 3 代經流式細胞儀鑒定的目的人臍帶來源間充質干細胞，棄去培養液，PBS 洗滌 3 遍，0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化收集細胞并計數。每管加 1 × 107個細胞懸液，以 1200 r/min離心 5 min，小心棄去上清液，加入 l00 μl DMEM/F12（含 10% FBS）培養基，再次混勻細胞呈細胞懸液，用移液槍吸取細胞懸液以滴種方法種植在已經消毒的脫細胞軟骨細胞外基質取向支架上，成功構建組織工程軟骨復合體，2 h 后加 5 ml 同樣培養液，繼續培養 3 d 后準備移植至山羊膝關節全層軟骨缺損處。

1.2.3 組織工程軟骨復合體修復山羊膝關節負重區全層軟骨缺損體內試驗 具體手術過程見圖 1，待手術的山羊在手術實施前禁食 12 h，禁水 4 h，右膝關節備皮。所有實驗動物均在速眠新II（0.15 ml/kg）肌肉注射麻醉后聯合鹽酸丁卡因（1 mg/kg）膝關節局部浸潤麻醉，仰臥固定于手術臺上將右側膝關節剪毛及消毒，鋪巾，取膝關節內側切口切開皮膚，沿髕旁內側入路切開關節囊，將髕骨連同髕韌帶一起推向外側，充分暴露股骨內、外側髁，用眼科角膜環鉆分別在股骨內、外側髁處旋轉式切下一直徑為 6.5 mm，深度約 1.5 mm 的圓形軟骨組織，造成全層關節軟骨缺損。注意在旋轉切割時應一邊旋轉環鉆，一邊由助手協助用無菌生理鹽水沿環鉆周邊滴注，防止旋轉產熱損傷周邊軟骨組織，同時注意鉆切的缺損深度，防止損傷軟骨下骨結構。在全層軟骨缺損造模完成的基礎上，根據實驗分組進行不同處理。實驗組手術：取準備好的無菌的復合人臍帶間充質干細胞的組織工程軟骨復合體放在軟骨缺損處并用生物蛋白膠粘貼固定。對照組手術：在全層軟骨缺損造模的基礎上不做處理。清理關節腔，髕骨復位，逐層縫合關節囊、筋膜及皮膚。術后把羊放置于溫暖環境，做好分組標記，肌肉注射青霉素 160 萬單位/d，連續 5 d，預防感染發生。術后實驗動物圈養，自由活動。

圖 1 人臍帶間充質干細胞復合在脫細胞軟骨細胞外基質取向支架構建的組織工程軟骨修復山羊膝關節全層軟骨缺損的手術過程（A：正常膝關節；B：膝關節股骨髁造直徑為 6.5 mm 的全層軟骨缺損，右上角為切下的軟骨組織；C1：空白對照組；C2：實驗組）

Figure 1 The operation process showed hUCSCs combined with ACECM oriented scaffold was transplanted to repair articular cartilage defects in caprine model [A: Normal knee joint; B: Cartilage damaged model with 6.5 mm diameter and removed cartilage tissue (top right corner); C1: Blank control group; C2: Experimental group]

1.2.4 主要觀察指標

1.2.4.1 炎癥反應水平：在手術后第7和 14 天，分別在無菌操作下抽取山羊手術膝關節關節液進行外觀觀察和關節液涂片 H&E 染色，觀察關節液細胞類型和任意 3 個視野內炎癥細胞所占的比例，分析炎癥反應程度。

1.2.4.2 大體觀察及形態學評分 分別在術后的第3、6 個月通過安樂死的方式處死山羊，取材觀察山羊膝關節軟骨缺損處的軟骨修復情況，并通過國際軟骨修復大體形態學評分進行評分。

1.2.4.3 組織學染色 將取材的標本用 4% 中性甲醛緩沖液固定1周，配制 100 g/L 的 EDTA 和 40 g/L 的 NaOH 混合溶液脫鈣，再經梯度酒精脫水，常規石蠟包埋，切片。分別作H&E、甲苯胺藍和天狼猩紅染色，檢測軟骨缺損的修復情況，并采用 MODS（Modified O’Driscoll Score）評分系統對修復組織進行組織學評分。

1.2.4.4 糖胺多糖定量檢測 將取材新鮮的標本用與實驗手術所用的同一大小的角膜環鉆以損傷區為中心環形旋轉切割缺損修復區，除去軟骨下骨組織，用蒸餾水洗干凈。參照組織糖胺多糖比色法定量檢測試劑盒步驟測定每個標本中糖胺多糖的含量，比較分析兩組間的差異。

1.3 統計學處理

采用 SPSS 19.0 軟件對各組、各時間點的數值進行單因素方差分析，以< 0.05 表示差異有統計學意義。

圖 2 人臍帶間充質干細胞的獲取、培養及鑒定（A：人臍帶組織；B：分離、培養的人臍帶間充質干細胞光鏡下細胞形態結果）

Figure 2 The resource, culturing and identification of hUCSCs (A: Human umbilical cord; B: The result of hUCSCs in light microscope)

2 結果

2.1 人臍帶間充質干細胞的培養、鑒定及死活細胞染色

光鏡下人臍帶間充質干細胞呈細長紡錘形，處于分裂期細胞較多，細胞生長旺盛，見圖 2。第三代人臍帶間充質干細胞流式細胞儀檢測結果報告顯示細胞表面抗原高表達 CD44、CD73、CD90、CD105（陽性率均≥ 95%），不表達造血細胞標記 CD34、CD45、HLA-DR（陽性率均 < 2%），具有干細胞生物學特性，見圖 3。第三代的臍帶間充質干細胞復合到生物軟骨支架后第 3 天，經死活細胞染色（FDA-PI）后激光共聚焦顯微鏡三維掃描成像觀察細胞生長良好，均勻分布在三維取向軟骨支架中，很少有死細胞存在，可見支架具有很好的生物相容性，見圖 4。

圖 3 人臍帶間充質干細胞的流式細胞儀鑒定結果（CD44、CD105、CD90 及 CD73 的陽性率均在 95% 以上）

Figure 3 The surface markers of hUCSCs (flow cytometry, CD44+, CD105+, CD90+and CD73+> 95%)

圖 4 人臍帶間充質干細胞復合在脫細胞軟骨細胞外基質取向支架后 3 d 的死活細胞染色（FDA/PI）共聚焦結果，紅色熒光為死細胞，綠色熒光為活細胞

Figure 4 The live/dead cells test results of hUCSCs after seeded in ACECM oriented scaffold was performed by FDA/PI after 3 d, confocal microscopy, red means dead cells, green means live cells

2.2 炎癥反應

在術后第7 天和 14 天兩組實驗動物膝關節關節液 H&E 染色結果顯示以少量中性粒細胞為主，散在巨噬細胞分布，平均每個低倍鏡視野炎性細胞的數量沒有明顯的差異，實驗組較對照組沒有明顯的炎癥反應差異，見圖 5。

空白對照組 實驗組 Blank control group Experimental group 7 d14 d

Figure 5 The H&E staining results of knee joint fluid after operation (× 100, optical microscope)

2.3 標本大體觀察及大體形態學評分

所選用普通成年雄性山羊 6 只，無一只動物術后發生感染或死亡，均在第一次手術后 3 或6 個月取材進入結果分析。3 個月的實驗結果顯示，在實驗組可見軟骨缺損尺寸較對照組已經明顯減小，新生軟骨樣組織覆蓋了軟骨下骨，缺損處與正常軟骨邊緣整合良好；對照組缺損處暴露的全層軟骨缺損大小與最初造模時相近，只有缺損邊緣可見極少量纖維結締組織生成。在術后 6 個月，實驗組的軟骨缺損處幾乎完全被新生軟骨組織所填充修復，表面光滑，周邊與宿主組織整合完好；而對照組缺損還較大，新生組織較少（圖 6）。國際軟骨修復協會-軟骨修復大體評分結果也證實實驗組（3 個月：5.4 ± 1.2；6 個月：18.7 ± 2.2）修復效果明顯優于對照組（3 個月：0.6 ± 0.1；6 個月：2.3 ± 1.6），差異具有統計學意義（< 0.05）。

空白對照組 實驗組 Blank control group Experimental group 3 個月3 months6 個月6 months國際軟骨修復大體形態學評分ICRS score2520151050空白對照組Blank control group實驗組Experimental group 3 個月 6 個月 A3 months 6 monthsB

Figure 6 The gross morphology (A) and ICRS score (B) of repaired knee joints in 3-month and 6-month (*significant different between two groups,< 0.05)

2.4 組織學染色及組織學評分

H&E 染色結果顯示，3 個月時，實驗組缺損處已被新生組織部分填充并覆蓋軟骨下骨，新生組織與周邊組織過渡整合自然且緊密，空白對照組缺損處無新生組織，軟骨下骨暴露；6 個月時，實驗組新生組織已經填充軟骨缺損處，并與周邊組織界面齊平，可見有早期的軟骨陷窩形成，空白對照組缺損處有一薄層新生組織覆蓋于軟骨下骨表面，見圖 7A。

甲苯胺藍染色結果顯示，3 個月時，對照組與實驗組染色均為陰性，實驗組新生組織為不成熟軟骨組織；在 6 個月結果中，實驗組甲苯胺藍染色較深，明顯優于空白對照組，其新生組織表現為較為成熟的軟骨組織，見圖 7A。

天狼猩紅染色結果顯示，在偏光鏡下觀察，實驗組在 3 個月時修復區呈現為緊密排列，強雙折光性的黃色或紅色為主要的I型膠原纖維；6 個月時，實驗組呈現為弱雙折光，多種色彩的疏松網狀分布為主的II型膠原纖維，空白對照組則呈現紅色的強雙折光的 I型膠原纖維為主的修復，見圖 7A。

組織學評分結果進一步得出實驗組（3 個月：6.3 ± 2.3；6 個月：15.0 ± 1.9）相對于空白對照組（3 個月：2.1 ± 1.9；6 個月：5.1 ± 0.5）在不同的時間點都獲得了更好的修復效果，差異具有統計學意義（< 0.05）（圖 7B）。

3 個月 6 個月3 months 6 months空白對照組 實驗組 空白對照組 實驗組Blank control group Experimental group Blank control group Experimental group H&E甲苯胺藍Toluidine blue天狼猩紅Sirius redA

Figure 7 H&E staining, toluidine blue staining, sirius red staining (A) and histologcal grading results of repair region of knee joints (B) (*significant different between two groups,< 0.05)

2.5 糖胺多糖的測定

糖胺多糖的定量檢測結果證實，實驗組（3 個月：68.7 ± 5.1 μg/樣本；6 個月：132.7 ± 9.0 μg/樣本）無論在術后 3 個月還是 6 個月，均要顯著高于空白對照組（3 個月：18.3 ± 7.1 μg/樣本；6 個月：38.3 ± 10.0 μg/樣本），差異具有統計學意義（< 0.05）（圖 8）。

糖胺多糖含量（μg/樣本）Quantification ofglycosaminoglycan (μg/sample)150100500空白對照組Blank control group實驗組Experimental group 3 個月 6 個月 3 months 6 months

Figure 8 The quantification of glycosaminoglycan of repair region results (*< 0.05)

3 討論

關節軟骨損傷的修復至今仍是醫學界面臨的重大難題之一。盡管軟骨修復方法很多，但是尚缺乏能夠獲得長期有效修復效果的再生策略。本實驗立足于組織工程再生理念，以人臍帶來源間充質干細胞為種子細胞，復合脫細胞軟骨細胞外取向支架，構建的組織工程軟骨復合體，成功地實現了山羊膝關節負重區的全層軟骨缺損的修復，證實了臍帶間充質干細胞復合脫細胞軟骨細胞外取向支架構建的組織工程軟骨用于軟骨損傷修復的可行性。

近年來，人臍帶間充質干細胞因其不但具有成體干細胞多項分化潛能的一般特性，還具有多方面的優勢，如細胞的分離操作簡單、不需酶的消化或其他的提純步驟就能夠獲得細胞表型更均一的細胞、對宿主無侵入性損傷、無倫理學爭議、細胞來源不受限等，迅速成為組織工程領域研究熱點之一[9-10]。在分離培養過程中，不需經過體外酶的組織消化，這使得獲得的種子細胞表型更加均一。光鏡下觀察呈現纖維細胞樣形態，細胞表面抗原高表達CD44、CD73、CD90、CD105，不表達造血細胞標記 CD34、CD45、HLA-DR。且細胞分離過程簡單，干細胞的獲取效率高。在我們實驗中證實，細胞復合在支架后 3 d，共聚焦顯微鏡觀察細胞已經布滿整個支架，且死/活細胞染色結果證實細胞在三維支架中生長良好，幾乎無死亡細胞出現。異種細胞的移植實驗往往存在免疫排斥反應，但是本實驗術后3 d 的關節液檢測結果卻顯示，實驗組和對照組的關節炎癥無明顯差異。這可能和人臍帶間充質干細胞相對于成體間充質干細胞更為幼稚，免疫原性更低有關。

另外，和傳統應用間充質干細胞修復軟骨損傷的研究方法不同，本實驗的人臍帶間充質干細胞沒有進行成軟骨誘導。但是從體內修復結果中證實，實驗組較對照組獲得了很好的修復效果。從大體觀察及組織學層面結果均證實，未經過誘導成軟骨的人臍帶間充質干細胞復合脫細胞軟骨細胞外取向支架構建的組織工程軟骨能夠實現全層軟骨缺損的修復。在 6 個月甲苯胺藍組織學染色結果中可見實驗組修復區已有大量的成熟細胞外基質分泌；天狼猩紅染色結果可見實驗組修復區組織膠原成分和正常組織非常相近。另外，糖胺多糖定量檢測結果也顯示，實驗組糖胺多糖含量遠高于對照組。這說明不經過成軟骨誘導的人臍帶間充質干細胞也能夠獲得較好的體內軟骨修復效果。這一研究結果與前期研究，認為人臍帶間充質干細胞較其他成體組織來源間充質干細胞具有更好的軟骨分化潛能結論相吻合[11-12]。研究認為這可能與人臍帶組織中富含透明質酸有密切關聯。透明質酸也是軟骨組織中的固有的天然成分，體外實驗發現在添加透明質酸的細胞培養微環境中能夠增強間充質干細胞的成軟骨分化作用[13-14]，這可能是人臍帶間充質干細胞更容易向軟骨分化的原因之一。在我們的試驗中，人臍帶間充質干細胞是復合在脫細胞軟骨細胞外基質取向支架中，該支架材料包含了大量的軟骨細胞外基質成分，如膠原成分、糖胺多糖及透明質酸等，有利于細胞的黏附、增殖和分化[15]。支架的取向仿生結構有利于引導種子細胞定向分布，提高新生組織的力學性能[16]。因此，人臍帶間充質干細胞復合脫細胞軟骨細胞外基質取向支架構建的組織工程軟骨是很有應用前景的組織工程軟骨修復策略。另外一些研究結果也顯示，臍帶間充質干細胞也具有很好的生物調節作用，通過分泌生物活性物質，如趨化因子和分化因子，促進周圍組織細胞的遷移、增殖和分化，為軟骨修復提供良好的微環境，促進損傷軟骨的修復[17-18]。綜合以上各種因素，共同促進了人臍帶間充質干細胞復合脫細胞軟骨細胞外取向支架構建的組織工程軟骨對損傷軟骨的修復作用。

本實驗旨在探討人臍帶間充質干細胞復合脫細胞軟骨細胞外取向支架構建組織工程軟骨修復大動物（山羊）膝關節負重區軟骨損傷的可行性，實驗結果證實該方法行之有效，而且極具臨床轉化和應用前景。但本研究沒有進行人臍帶間充質干細胞修復軟骨損傷的體內轉歸機制方面的探索，修復有效性的觀察時間也相對較短。因此，我們下一步研究重點將主要關注在人臍帶干細胞的體內轉歸機制，并進一步觀察其遠期的修復效果，為臨床的轉化與應用提供更為有力的證據。

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Repair of goat full-thickness cartilage defects using tissue engineering cartilage constructed by the ACECM-oriented scaffold seeded with hUCSCs

ZHANG Yu, LIU Shu-yun, GUO Wei-min, HAO Chun-xiang, WANG Ming-jie, YUAN Zhi-guo, HUANG Jing-xiang, SUI Xiang, ZHANG Li, LU Shi-bi, GUO Quan-yi

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Objective To explore the effectiveness of human umbilical cord derived stem cells (hUCSCs) combined with the acellular cartilage extracellular matrix oriented scaffold on the repair of full-thickness cartilage defects in big animal (goat).Methods hUCSCs were acquired from human umbilical cords. The oriented scaffold was made from acellular cartilage extracellular matrix of swine in our laboratory. The full-thickness and 6.5 mm diameter cartilage defects were made in the knee weight-bearing area (medial and lateral articular condyle) of adult goats. All of goats were randomly divided into two groups, including control group and experimental group (hUCSCs combined with the acellular cartilage extracellular matrix oriented scaffold treatment group). 7 and 14 d after operation, synovial fluid was extracted to demonstrate the inflammation. After 3 or 6 months, the two groups of animals were euthanized to analysis on gross morphology and histopathology.Results ①The results from H&E staining of synovial fluid smears showed that there was no significant difference in the inflammatory response of knee joint between the two groups. ②The gross morphology and histology staining confirmed that the regenerated articular cartilage of the experimental group was closer to the natural cartilage and had better integration with the surrounding area and better repairing effect. What’s more, the grade scores of the gross morphology and histopathology were higher in the experimental group than that of the control group in both 3 and 6-month (< 0.05). ③The results of quantitative detection of glycosaminoglycans in the experimental group were significantly higher than those in the control group (< 0.05).Conclusion The tissue engineering cartilage is constructed by hUCSCs combined with the acellular cartilage extracellular matrix oriented scaffold and repairs successfully the full-thickness cartilage defect in caprine model, and this method is a promise strategy on regeneration of cartilage in future.

Mesenchymal stem cell; Extracellular matrix; Tissue scaffolds; Tissue engineering; Cartilage, articular

GUO Quan-yi, Email: doctorguo_301@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2016.06.004

國家自然科學基金（81472092）；國家高技術發展研究計劃（863 計劃）（2015AA020303）

100853 北京，中國人民解放軍總醫院骨科研究所/骨科再生醫學北京市重點實驗室/全軍骨科戰創傷重點實驗室（張雨、劉舒云、郭維民、王明杰、苑志國、黃靖香、眭翔、張莉、盧世璧、郭全義），麻醉科（郝春香）

郭全義，Email：doctorguo_301@163.com

2016-10-10

Author Affiliations: Institute of Orthopaedics, Beijing Key Lab of Regenerative Medicine in Orthopaedics, Key Lab of Musculosketal Traums & Injurious PLA (ZHANG Yu, LIU Shu-yun, GUO Wei-min, WANG Ming-jie, YUAN Zhi-guo, HUANG Jing-xiang, SUI Xiang, ZHANG Li, LU Shi-bi, GUO Quan-yi); Anesthesia Department (HAO Chun-xiang), Chinese PLA General Hospital, 100853 Beijing, China