白血病染色體MLL基因斷裂（易位）FISH探針的研究

孫江漫，胡林萍，李承文，陸宏卿，薛衛(wèi)霞，程濤，繆為民

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白血病染色體基因斷裂（易位）FISH探針的研究

孫江漫，胡林萍，李承文，陸宏卿，薛衛(wèi)霞，程濤，繆為民

目的 自主研制可以檢測白血病染色體基因斷裂的雙色 FISH 檢測試劑盒。方法 根據(jù)染色體基因圖譜，選定合適的 BAC 克隆重疊群分別作為基因斷裂點 5' 端探針和 3' 端探針。采用缺口平移法，制作出 5' 端標記綠色熒光素，3' 端標記紅色熒光素的探針。用雙盲法檢測白血病臨床樣本 40 例，對自制探針和同類進口探針在各項技術(shù)參數(shù)上進行對比研究。結(jié)果 自制探針檢測基因斷裂（易位）的陰、陽性率與同類進口產(chǎn)品完全相符；在 Spectrum Green 和 Cy3? v1 通道中，自制探針的平均熒光信號強度比進口探針明顯提高（自制探針分別為：2930.5 ± 38.00，2766 ± 59.54；進口探針分別為：2239 ± 45.13，1986 ± 59.56；< 0.01），自制探針信噪比分別為進口探針的 2.4 倍和 1.9 倍。結(jié)論 自制的基因 FISH 檢測探針設(shè)計合理、質(zhì)量可靠，與進口探針相比，熒光信號更強，信噪比更高，將來可能替代價格昂貴的進口產(chǎn)品。

白血病； 髓淋巴細胞性白血病蛋白質(zhì)； 易位，遺傳； 原位雜交，熒光； FISH 探針

位于染色體 11q23 的混合譜系白血病（mixed lineage leukemia，MLL）基因的重組可以在 85% 的兒童 B 型急性淋巴細胞性白血病（acute lymphoid leukemia，ALL）細胞中檢測到[1-2]。該基因和果蠅基因 trithorax 同源，在人類高度保守，表達一種含 6 個鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，是一種發(fā)育調(diào)控蛋白。基因具有維護基因的功能，而后者在發(fā)育調(diào)節(jié)中具有重要功能。基因的鋅指功能區(qū)分別和1、3 和11 等基因發(fā)生易位融合 t(4;11)、t(11;19) 和 t(11;19)。這些易位基因都具有高度的同源性。(11q23) 基因易位和治療失敗密切相關(guān)[3]。其中，最常見的易位是 t(4;11)，涉及基因和位于 4 號染色體的1(AF4) 基因[4-5]，含有這種基因重組的 ALL 兒童的臨床預(yù)后很差。因此，檢測基因是否發(fā)生斷裂（易位）對于該類型白血病的診治具有重要臨床意義。

目前，熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）是用于檢測染色體易位的首選方法。國際上有美國 Abbott 公司等生產(chǎn)的雙色分離探針用于檢測基因斷裂狀況，但價格昂貴。國內(nèi)公司尚無國家食品和藥品監(jiān)督管理局（CFDA）注冊的 MLL 分離探針，難以完全滿足臨床需要。本文擬對血液病臨床常用的基因斷裂 FISH 檢測試劑盒進行研制，并與同類進口產(chǎn)品相比較，結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及儀器 質(zhì)粒純化試劑盒購于德國 Qiagen 公司；R I、ssDNA、tRNA 購于美國 Sigma 公司；DNA polymerase I、人 cot-DNA、SSPE 購于美國 Invitrogen 公司；Spectrum Green-dUTP 購于美國 Abbott Molecular 公司；PromoFluor-555-dUTP 購于美國 PromoKine 公司；進口探針購于美國 Vysis 公司。Axioimager Z2 型熒光顯微鏡為德國Carl Zeiss 公司產(chǎn)品；ThermoBrite 原位雜交儀為美國Abbott Molecular公司產(chǎn)品。

1.1.2 標本來源 選擇在本院就診的血液病患者骨髓樣本。

1.2 方法

1.2.1 制片過程 取骨髓樣本，用 0.075 mol/LKCl 低滲去除紅細胞，細胞甩片后用甲醇室溫固定過夜，第 2 天用 2% 甲醛固定 5 min 后，儲存于–20 ℃ 70% 乙醇中，使用時依次在 70%、85%、100% 梯度乙醇中脫水，晾干后 FISH 檢測備用。

1.2.2 探針設(shè)計 使用 UCSC Genome Bioinformatics 數(shù)據(jù)庫定位檢索細菌人工染色體（bacterial artificial chromosome，BAC）克隆[6]。選擇定位于 11q23 包含基因斷裂點 5'端的 BAC克隆重疊群（圖 1，包括 3 個 BAC 克隆），將該 BAC 克隆群標記綠色熒光素作為 5'端探針；選擇定位于基因斷裂點 3'端的 BAC 克隆群（圖 1，包括 2 個 BAC 克隆），將 BAC 克隆群標記紅色熒光素作為 3' 端探針（表 1）。質(zhì)粒純化試劑盒分離提取 BAC 的 DNA，然后用RI 酶切。用缺口平移法以熒光素 Spectrum Green-dUTP、PromoFluo-555-dUTP 標記 DNA，乙醇沉淀，最后溶于雜交緩沖液。

圖 1 MLL基因位于染色體 11q23（綠色長條表示包含MLL基因斷裂點 5' 的 BAC 克隆重疊群，包含 STS 標志 D11S1374，長度達 400 kb；紅色長條表示包含MLL基因斷裂點 3' 的 BAC 克隆重疊群，包含 STS 標志 D11S3207，長度達 250 kb）

Figure 1gene is located at chromosome 11q23 (The green strip shows BAC clone contigs located on the 5' side of the break point of thegene which includes D11S1374 marker and the length is 400 kb; The red strip shows BAC clone contigs located on the 3' side of the break point of thegene which includes D11S3207 marker and the length is 250 kb)

表 1 探針制備及使用 BAC 克隆編碼

注：克隆編碼為本實驗室自編。

Note: The clone coding was made by our laboratory.

1.2.3 FISH 檢測 取制備好的骨髓片加入探針，加蓋蓋玻片，用封片膠封片后 85 ℃變性 5 min，47 ℃雜交 24 h。47 ℃核酸雜交緩沖液 SSPE 洗滌 5 min。55 ℃洗滌 10 min，梯度乙醇中脫水后加 DAPI 復(fù)染細胞核，加 Zeiss 蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察，拍照。

1.2.4 圖像采集及 FISH 信號的判斷 用Axioimager Z2 型熒光顯微鏡，在 DAPI 圖像下選擇視野，定位，記錄圖像采集位置。分別于 Spectrum Green 和 Cy3? v1 濾光片下觀察間期細胞熒光雜交信號。于63 倍油鏡下在 DAPI、Spectrum Green、Cy3? v1 通道中采集細胞核和2種熒光素的原始圖像，軟件分析合成最后的分類圖像，照相記錄。采用 AxioVisionRel.4.8 軟件分析測量圖像，評估探針雜交情況[7]。每張玻片選擇 10 個區(qū)域拍照，每個通道分別測量 200 個以上細胞的平均熒光強度和背景強度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 將熒光素標記的 BAC 探針和已知基因 正常的白血病細胞雜交

將綠色熒光素 Spectrum Green 標記的 5'探針和紅色熒光素 PromoFluor-555 標記的 3'探針混合，和基因正常的白血病細胞進行雜交，可以檢出 2 個黃色的融合信號（紅綠色信號融合顯示黃色），提示該白血病細胞 2 個基因拷貝均沒有發(fā)生斷裂（圖 2）。

2.2 自制探針和進口探針用于檢測同一例已知白血病 MLL 染色體易位陽性的樣本

結(jié)果顯示自制探針（圖 3）和進口探針（圖 4）均可檢出一個獨立的紅色信號和一個獨立的綠色信號，以及 1 個紅色和綠色融合信號（黃色），結(jié)果提示，該患者含有一個正常的基因拷貝，另一個拷貝的基因發(fā)生了斷裂（圖 3）。

2.3 自制和進口 FISH 探針的對比研究

通過雙盲法檢測了 40 例臨床血液病門診樣本，結(jié)果顯示自制和進口 FISH 探針均檢測到其中相同的 7 例基因斷裂（易位）陽性的樣本，兩者陰、陽性檢測結(jié)果完全相符。在 Spectrum Green和 Cy3? v1 通道中，自制探針的平均熒光信號強度比進口探針明顯提高（自制探針分別為：2930.5 ± 38.00，2766 ± 59.54；進口探針分別為：2239 ± 45.13，1986 ± 59.56；< 0.01，圖 5），自制探針信噪比分別為進口探針的 2.4 倍和 1.9 倍（圖 5）。

圖 2 將標記綠色熒光素的 5'探針和標記紅色熒光素的 3' 探針和已知MLL基因正常的白血病細胞進行雜交，可以檢出2 個黃色的融合信號（紅綠色信號融合顯示黃色）（A：細胞核；B：MLL基因 5' 端綠色熒光信號；C：MLL基因 3' 端紅色信號；D：MLL基因正常的黃色融合信號）

Figure 2 The 5' probe labeled with green fluorescein and the 3' probe labeled red fluorescein were hybridized with a leukemia sample containing a normalgene revealed two yellow fusion signals (red-green signal fusion displays as yellow colour) (A: Nucleus; B: The green fluorescent signal of the 5' side ofgene; C: The red fluorescent signal of the 3' side ofgene; D: The yellow fusion signal of the normalgene)

圖 3 自制探針檢測一例已知 MLL 染色體易位陽性的患者骨髓樣本（5'探針標記成綠色，3'探針標記成紅色；該患者含有一個正常的MLL基因拷貝，另一個拷貝的MLL基因發(fā)生了斷裂）（A：細胞核；B：MLL基因 5' 端綠色熒光信號；C：MLL基因 3' 端紅色信號；D：MLL 染色體異位 FISH 雜交檢出 1 個獨立的紅色信號，1 個獨立的綠色信號，1 個紅綠融合信號）

Figure 3 The self-developedprobes were used to detect a patient bone marrow sample with a knowntranslocation (The 5' and 3' FISH probes were labeled with red and green fluorophores respectively; The results suggested that the patient contains a normal copy and a broken copy ofgene) (A: Nucleus; B: The green fluorescent signal of the 5' side ofgene; C: The red fluorescent signal of the 3' side ofgene; D: FISH hybridization displayed a separate red signal, a separate green signal, a red and green fusion signal of the translocatedgene)

圖 4 進口探針檢測同一例已知 MLL 染色體易位陽性的患者骨髓樣本（5'探針標記成綠色，3'探針標記成紅色；該患者含有一個正常的MLL基因拷貝，另一個拷貝的MLL基因發(fā)生了斷裂）（A：細胞核；B：MLL基因 5' 端綠色熒光信號；C：MLL基因 3' 端紅色信號；D：MLL 染色體異位 FISH 雜交檢出 1 個獨立的紅色信號，1 個獨立的綠色信號，1 個紅綠融合信號）

Figure 4 The commercial imported FISH probes were used to detect a patient bone marrow sample with a knowntranslocation (The 5' and 3' FISH probes were labeled with red and green fluorophores respectively; The result suggested that the patient contains a normal copy and another broken copy ofgene) (A: Nucleus; B: The green fluorescent signal of the 5' side ofgene; C: The red fluorescent signal of the 3' side ofgene; D: FISH hybridization displayed a separate red signal, a separate green signal, a red and green fusion signal of the translocatedgene)

熒光強度The intensity of the fluorescence40003000200010000熒光信號Fluorescencesignal背景信號Backgroud 進口探針自制探針 進口探針自制探針I(yè)mported Self-made Imported Self-madeprobes probes probes probes 綠色熒光 紅色熒光Green fluorescence Red fluorescence

Figure 5 Comparison of average fluorescence intensity and background intensity of self-made and imported probes in green channel and red channel (The average fluorescence intensities of the self-made probes in both the green and red channels were higher, and the background intensities were lower than those of the imported probes, and the signal-to-noise ratioes of our green and red fluorescence-labeled probes were 2.4 and 1.9 times those of the imported probes,*< 0.01)

3 討論

白血病是由各種不同的遺傳變異引起的造血干祖細胞性疾病，具有很大的異質(zhì)性。染色體重排引起的融合蛋白是引起白血病的重要發(fā)病機制，而且基因重排在白血病的發(fā)生發(fā)展中扮演著相當重要的角色。近年來，F(xiàn)ISH 對于檢測白血病細胞中的染色體變異，如染色體重排、缺失、擴增等已成為一種金標準。因此，F(xiàn)ISH 檢驗對于白血病等血液病的早期診斷、鑒別診斷、分子病理分型、預(yù)后及靶向治療均具有重要的意義，已成為血液病理診斷中不可缺少的部分[8-9]。

然而由于技術(shù)原因，我國血液病理 FISH 診斷主要依靠進口產(chǎn)品，進口產(chǎn)品不僅價格昂貴，而且購買需要復(fù)雜的程序，時間消耗長，因此難以滿足國內(nèi)眾多患者的需求。此外，國內(nèi)分子生物試劑公司的 FISH 產(chǎn)品主要以檢測實體腫瘤和遺傳病為主，其獲得 CFDA 批文的血液病 FISH 試劑盒種類較少。鑒于此種狀況，作為國內(nèi)較大的血液病專科醫(yī)院和血液病研究所，我們很有必要自主開發(fā)高品質(zhì)的國產(chǎn)血液病 FISH 系列產(chǎn)品。

本文自主設(shè)計基因 FISH 探針，采用多個 BAC 克隆組成的克隆重疊群作為探針，大大提高了 FISH 雜交熒光信號的強度，同時我們在雜交緩沖液中加入 ssDNA、tRNA 和 cot-DNA 等試劑封閉基因組中的重復(fù)序列，使得非特異背景雜交信號顯著下降，信噪比進一步提高，大幅度增強了基因信號的強度及可視性。除了通過正常人二倍體成纖維細胞的驗證，我們對本院 40 例臨床血液病骨髓樣本檢測的結(jié)果顯示，自制和進口 FISH 探針在檢測 MLL 染色體斷裂（易位）的結(jié)果是完全相符的。此外，由于熒光雜交信號強度跟所用探針的 DNA 片段長度有關(guān)，我們在設(shè)計中采用了多個 BAC 克隆重疊群組成的加長探針，提高了檢測信號的強度。對比實驗表明，自制試劑盒在各個熒光通道里信號的平均熒光強度較高，雜交的背景較低，拍照所需的曝光時間短，熒光信號衰減程度低，大大提高了 FISH 檢測的效率和準確性，為白血病的診斷、分型、治療和預(yù)后提供了更為可靠的依據(jù)。因此，自制試劑盒的各項技術(shù)指標均達到了國外同類產(chǎn)品的標準，而且其高信號強度和低信噪比的優(yōu)勢使之替代價格昂貴、進口繁瑣的國外產(chǎn)品成為可能。

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Development of FISH probes for detection ofgene breakage (translocation) in leukemia

SUN Jiang-man, HU Lin-ping, LI Cheng-wen, LU Hong-qing, XUE Wei-xia, CHENG Tao, MIAO Wei-min

Guojia

Objective In this work, we aim to develop the dual-colour FISH kit for detectinggene chromosomal translocation, one of common genomic aberrations in certain type of leukemia.Methods Based on the chromosome and gene map, corresponding BAC clone contigs were selected as 5' and 3' FISH probes located on each side of the break point of thegene. The 5' and 3' FISH probes were labeled with red and green fluorophores, respectively, by nick translation. The self-developed FISH kit and the commercial imported one were compared in terms of multiple technical parameters in the double blind study of 40 cases of clinical hematological samples.Results The detection results were consistent between the self-developed FISH kit and the commercial imported one with regard to detectinggene breakage. The self-developed probes showed stronger average fluorescence intensities in spectrum green and Cy3? v1 channels (for the self-developed probes: 2930.5 ± 38.00, 2766 ± 59.54, respectively; for the commercial imported FISH probes: 2239 ± 45.13, 1986 ± 59.56;< 0.01, respectively). The signal noise ratios for the self-developedprobes were 2.4 and 1.9 times, respectively, of those respective imported probes.Conclusions The self-developedprobes in this work have reasonable design and reliable quality. Furthermore, the self-developed probes have stronger fluorescence signal intensities and better signal noise ratios than the imported probes do. Thus, the FISH probes developed could serve as a domestic replacement for the expensive imported products.

Leukemia; Myeloid-lymphoid leukemia protein; Translocation, genetic; In situ hybridization, fluorescence; FISH probes

MIAO Wei-min, Email: miaowm@hotmail.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2016.06.003

國家自然科學(xué)基金（81400150、81370598）；天津市科委項目（14ZCDZSY00176）；江蘇省科技型企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新資金（BC2015057）；南京市 321 人才計劃；協(xié)和青年科研基金資助；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金（3332016090）；科技支撐重大疾病防治專項（09ZCZDSF03800）

300020 天津，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液病醫(yī)院血液學(xué)研究所實驗血液學(xué)國家重點實驗室（孫江漫、胡林萍、程濤、繆為民），血液病理中心（李承文）；211100 南京福隆特醫(yī)療科技有限公司（陸宏卿、薛衛(wèi)霞）

繆為民，Email：miaowm@hotmail.com

2016-09-30

Author Affiliations: State Key Laboratory of Experimental Hematology, Institute of Hematology (SUN Jiang-man, HU Lin-ping, CHENG Tao, MIAO Wei-min), Department of Pathology (LI Cheng-wen), Blood Disease Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 300020 Tianjin, China; Nanjing Fulongte Medical Technology Company, 211100 Nanjing, China (LU Hong-qing, XUE Wei-xia)