辣椒素預處理對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用的代謝組學研究

張 懿， 朱德生， 王 艷

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辣椒素預處理對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用的代謝組學研究

張 懿， 朱德生， 王 艷

目的 研究辣椒素預處理對大鼠局部腦缺血再灌注損傷的保護作用。方法 采用大腦中動脈栓塞方法建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，選用SD大鼠24只，適應1 w后隨機分為3組，假手術組(Sham)，模型組(Mod)以及辣椒素預處理組(CAP，0.2 mg/kg)，每組8只，采用氣相色譜-質譜法(GC-MS)方法分析各組大鼠腦組織皮質樣本，運用主成分分析(PCA) ，偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)，正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)，進行差異化合物篩選和鑒定。結果 OPLS-DA得分圖能夠較明顯的區(qū)分各組樣本。根據(jù)變量重要性投影值(VIP)和載荷圖，并結合t檢驗的P值(P<0.05)來篩選差異表達代謝物。與假手術組大鼠相比，模型組大鼠的皮質代謝譜明顯不同，興奮性氨基酸谷氨酸(P<0.05)、肌醇(P<0.01)等代謝物出現(xiàn)顯著增高；花生四烯酸(P<0.01)、異亮氨酸(P<0.001)、甲硫氨酸(P<0.001)、L-半胱氨酸(P<0.001)、天冬氨酸(P<0.05)、苯丙氨酸(P<0.05)等氨基酸、1-磷酸-葡萄糖(P<0.05)、6-磷酸-葡萄糖(P<0.01)等糖代謝物出現(xiàn)顯著降低。與模型組大鼠相比，辣椒素預處理組異亮氨酸、甲硫氨酸、L-半胱氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸等氨基酸恢復正常水平，3、5-二羥苯甘氨酸(P<0.001)等代謝物顯著增高。結論 代謝組學表明，發(fā)生腦缺血再灌注損傷時，皮質內能量代謝、神經遞質出現(xiàn)紊亂，辣椒素預處理可能通過改善對缺血腦組織的能量代謝障礙，緩解興奮性谷氨酸的釋放量，改善生物膜的功能對腦缺血再灌注損傷發(fā)揮保護作用。氣相色譜質譜技術能較為全面地反映生物體在藥物干預作用下的代謝狀態(tài)變化，并能通過代謝物含量的差異推斷藥物的作用機制，為研究腦缺血損傷機制和治療腦缺血藥物提供了新的思路。

TRPV1； 辣椒素； 腦缺血再灌注損傷； 代謝組學

腦缺血再灌注損傷(Cerebral Ischemia Reperfusion Injury) 是指腦缺血至腦組織壞死前，閉塞的腦血管再通后缺血性腦損傷進一步加重的現(xiàn)象[1]。腦缺血再灌注損傷涉及極其復雜的病理生理過程，主要包括興奮性氨基酸毒性、細胞內鈣超載、能量代謝障礙、氧自由基增多、內皮細胞損傷、凋亡基因激活、炎癥反應等多個環(huán)節(jié)[2～5]。如何防止缺血再灌注損傷，尋找有效的治療藥物及措施，促進腦卒中后中樞神經功能的恢復一直是腦血管病領域的研究熱點。

瞬時感受器電位香草酸受體-1(Transient Receptor Potential Vanilloid-1，TRPV1)是配體門控非選擇性陽離子通道，能夠被各種外因性及內因性的物理及化學刺激所激活，如：熱刺激(>43 ℃)、酸性環(huán)境(pH<5.9)、內源性大麻素花生四烯酸乙醇胺、炎癥因子、激動劑辣椒素(Capsaicin)等[6]。辣椒素是一種營養(yǎng)因子，是辣椒的主要成分，負責辣椒的刺激性成分。作為TRPV1高選擇性激動劑，辣椒素激活TRPV1并且在疼痛信息的傳遞整合[6]、改善血管功能預防心血管疾病[7]、自身免疫性疾病的調制[8]、抑郁癥等精神疾病的行為調節(jié)[9]等方面發(fā)揮重要作用，揭示了辣椒素可能作為治療疾病的靶標。

代謝組學(Metabonomics)是分析比較組織中和體液中的內源性代謝物、代謝產物的代謝譜的變化，獲得生理情況或病理狀況下的整體代謝狀況，有助于揭示尋找與疾病相關的潛在生物標志物[10]。近年來，代謝組學被廣泛應用于心臟疾病[11]、糖尿病[12]、腫瘤[13]等疾病研究，在神經系統(tǒng)疾病領域，也進行了涉及肌萎縮側索硬化癥(ALS)[14]、亨廷頓綜合征等運動神經退行性疾病[15]以及多發(fā)性硬化(MS)等神經免疫性疾病的代謝組學研究[16]，通過葡萄糖、氨基酸和脂質代謝以及神經遞質、核苷酸的變化，免疫反應和抗炎反應，獲得代謝譜用于疾病診斷、治療以及機制研究。目前已有研究表明，辣椒素預處理對缺氧新生大鼠的腦損傷具有血管保護作用，但具體作用機制尚不清楚[17]。同時藥物預處理不會造成短暫的缺血損傷，對缺血預適應構成一定的保護作用[18]。因此本研究擬采用大腦中動脈栓塞建立腦缺血再灌注損傷模型，建模前3 h進行辣椒素腹腔注射預處理，利用代謝組學的方法探討辣椒素預處理對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護及作用機制，為研究腦缺血損傷機制和治療腦缺血藥物尋找新的靶標。

1 材料與方法

1.1 試劑 TRPV1激動劑Capsaicin(CAS#：12084-10MG-F，Sigma，美國)，2，3，5-氯化三苯基四氮唑TTC(Sigma，美國)，L-2-氯苯丙氨酸(上海恒柏生物科技有限公司，中國)，衍生化試劑雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺BSTFA(REGIS Technologies，美國)，多聚甲醛、水合氯醛、氯化鈉、甲醇、氯仿等(國藥集團化學試劑有限公司，上海)。

1.2 儀器 手術顯微鏡(鎮(zhèn)江中天光學儀器有限責任公司，中國)，顯微手術器械套裝(無錫醫(yī)用器材廠)、Milli-Q去離子水制備儀(Millipore，美國)，超低溫冰箱(海爾醫(yī)療設備，中國)，MCAO栓線(北京沙東生物技術有限公司，中國)，研磨儀(JXFSTPRP-24，上海凈信科技有限公司，中國)，氣相色譜儀(Agilent 7890A，Agilent，美國)，高通量飛行時間質譜儀(Chroma TOF Pegasus HT，LECO，美國)，Restek Rxi-5Sil MS毛細管柱(J&W Scientific，F(xiàn)olsom，美國)。

1.3 實驗動物及處理

1.3.1 實驗動物 成年健康雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠48只，SPF級，體重180～220 g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，生產許可證：SCXK(滬)2012-0002。室溫25 ℃，自由攝水飲食，本研究的所有程序遵守實驗室動物的護理和使用指南。

24只SD雄性成年大鼠隨機分為3組：假手術組(Sham，n=8)，模型組(Mod，n=8)、辣椒素預處理組(CAP，n=8)。辣椒素預處理參照前人的研究，將辣椒素溶于1%DMSO中，缺血處理前3 h 以0.2 mg/kg的劑量腹腔注射[18]。缺血后24 h收集大腦組織樣本進行TTC染色測量梗死面積和缺血組織(Mod Q 、Cap Q)及缺血對側組織(Mod D 、Cap D)做GC-MS代謝譜分析。

1.3.2 大鼠大腦中動脈栓塞(Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO) 大腦中動脈閉塞(MCAO)方法是最廣泛使用的模擬缺血性腦卒中的理想模型。采用Longa等提出的大腦中動脈閉塞的制作方法并在稍作改進后制作模型[19]。2%水合氯醛腹腔麻醉大鼠(2%，0.2 ml /10 g b.w.)，麻醉后大鼠仰臥位固定，常規(guī)碘消毒頸部皮膚，右側頸部皮膚切口分離右側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內動脈(ICA)和動脈分支。采用頭端多聚賴氨酸包被處理的栓線(直徑0.18±0.02 mm)插入右頸內動脈(MCA)至大腦中動脈近端以阻斷大腦中動脈血流。90 min后輕輕拔出栓線恢復大腦中動脈供血實現(xiàn)再灌注。假手術組僅進行血管分離，不進行栓線插入處理。手術過程環(huán)境溫度保持在(37±0.5)℃，直至動物蘇醒送回動物房飼養(yǎng)、觀察。

1.3.3 神經功能缺損評分 待大鼠術后完全清醒后進行神經功能缺損評分[20]。神經功能缺損評分系統(tǒng)采用5分制，0分表示無神經系統(tǒng)缺損癥狀；1分表示左前肢屈曲；2分表示左側肢體對抗力下降，左前肢屈曲；3分表示向左側轉圈；4分表示不能自發(fā)行走，意識喪失。分值越高，說明動物神經功能缺損越嚴重。術后評分為1-3分示意為造模成功，納入模型組。

1.4 TTC染色 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色是測定缺血組織面積的常用方法。大鼠麻醉斷頭處死，迅速取出腦組織凍存于-20 ℃ 約20 min，由前向后每隔2.0 mm 作冠狀切片，將腦組織切成連續(xù)的2.0 mm冠狀切片，然后浸入2%的TTC的磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L，pH 7.4)，37 ℃ 避光水浴30 min，染色后4%多聚甲醛固定24 h，最后將每組腦片排列整齊，數(shù)碼相機拍照，通過圖像分析軟件(Image-pro Plus 6.0)對梗死面積進行分析。

1.5 氣相-質譜GC-MS

1.5.1 代謝物提取 代謝物的提取過程參照前人對樣品預處理的方法[21]。取50 mg大鼠腦組織樣品于2 ml離心管中，加入0.4 ml甲醇-氯仿(3∶1，v/v)混合溶液，再加入30 μl /L2氯苯丙氨酸作為內標，漩渦混勻，加入鋼珠，55 Hz 5 min研磨處理；然后12000 r/min 低溫離心5 min，小心取出約0.4 ml 上清于2 ml進樣瓶中，每個樣本取約13 μl 于新的2 ml進樣瓶中，混勻作為質控樣本。

1.5.2 代謝物衍生化 真空濃縮器中干燥提取物約1.5 h后，加入80 μl 甲氧胺鹽試劑(甲氧胺鹽酸鹽，溶于吡啶20 mg/ml)，輕輕混勻后，放入烘箱中37 ℃孵育2 h。

向每個樣品中迅速加入100 μl 衍生化試劑雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺BSTFA(含有1% TCMS，v/v)70 ℃孵育1 h，冷卻至室溫后，混合樣品中加入10 μl 飽和脂肪酸甲酯標準混合液FAMEs(溶于氯仿C8-C16：1 mg/ml；C18-C30：0.5 mg/ml)，混勻后以供GC-MS檢測。

1.5.3 氣相-質譜條件 氣相色譜儀安捷倫Agilent 7890A聯(lián)用高通量飛行時間質譜儀配Restek Rxi-5Sil MS毛細管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)。

色譜條件：進樣量，1 μl，不分流模式；載氣，氦氣；前進樣口吹掃流速，3 ml/min；柱流速：1 ml/min；柱溫，37 ℃保持1 min，以10 ℃每分鐘的速率上升至300 ℃，保持10 min；前進樣口溫度280 ℃。

質譜條件：離子源溫度，220 ℃；電離電壓，-70 eV；掃描方式，85～600 m/z；掃描速率，20 spectra/s；溶劑延遲，366 s。

1.6 數(shù)據(jù)處理和模式識別 將標準化處理后的數(shù)據(jù)包括樣品名稱、峰值、歸一化的峰面積等信息導入SIMCA-P 13.0 軟件(Umetrics，Umea，瑞典)進行主成分分析(PCA)、偏最小二乘判別分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)，分析結果用得分圖(Score Plot)和載荷圖(Loading Plot)表示。得分圖可以給出樣本在空間上的位置，載荷圖給出兩類間的代謝物變化。

PCA用來顯示原始數(shù)據(jù)樣品的總體分布。PLS-DA用來獲得數(shù)據(jù)(X變量)和其它變量(Y變量，分組信息)之間的相關關系，使用UV格式化處理的數(shù)據(jù)標度換算方式，對第一，二主成分進行建模分析。對模型的質量用7折交叉驗證進行檢驗，并用交叉驗證后得到的分類參數(shù)R2X 和Q2(分別代表模型可解釋的變量和模型的可預測度)對模型有效性進行評判。此后，通過排列實驗隨機多次(n=200)改變分類變量Y的排列順序得到相應不同的隨機Q2值對模型有效性做進一步的檢驗。對PLS-DA模型進行正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)，最大化地凸顯模型內部不同組別之間的差異，變量遠離原點越遠，表明差異貢獻越大。我們采用第一主成分的VIP(Variable Importance in the Projection)值(VIP>1)，并結合t檢驗(t-test)的P值(P<0.05)來篩選差異性表達代謝物，評價辣椒素預處理的干預作用。

2 結 果

2.1 辣椒素預處理后腦梗死面積減少 TRPV1激動劑辣椒素缺血處理前3 h以0.2 mg/kg的劑量腹腔注射，由腦片TTC染色圖可以看出(見圖1)，辣椒素預處理可以明顯降低腦梗死面積(81.88%減少至51.81%)(*P<0.05，#P<0.05)。辣椒素術后處理對梗死面積沒有明顯影響，與文獻報道結果相一致[17](結果未展示)。

2.2 神經功能缺損評分 神經功能缺損評分系統(tǒng)采用五分制。待大鼠術后完全清醒后進行神經功能缺損評分，評分結果表明術后模型組和辣椒素處理組大鼠均出現(xiàn)神經功能缺損癥狀，兩組的功能缺損評分均高于假手術組(*P<0.05)。無論是術后還是術后1 h，辣椒素預處理組神經功能缺損評分均有所下降，術后模型組評分為(3.31±0.48 )與辣椒素預處理組 (3.19±0.40)、術后1 h模型組(2.69±0.60) 與辣椒素預處理組(1.81±0.40)(#P<0.05)，說明辣椒素預處理對大鼠神經功能損傷有一定的改善(見圖2)。

2.3 氣相-質譜的穩(wěn)定性 各組大鼠腦組織樣本連續(xù)注射到氣相-質譜儀中，通過統(tǒng)計內標保留時間(Retention Time，RT)檢測系統(tǒng)的穩(wěn)定性，由表1可以看出，內標保留時間標準差為：0.00594，說明系統(tǒng)十分穩(wěn)定，可保證后續(xù)的實驗需要。

2.4 大鼠腦組織的代謝譜將假手術組、模型組以及辣椒素預處理組3組大鼠腦組織樣本進行衍生化后進樣分析，得到GC-MS總離子流圖(見圖3)，基于NIST質譜數(shù)據(jù)庫，共526個峰被鑒定為內源性代謝物，主要為氨基酸、有機酸、糖類、脂肪酸等物質，這些代謝物參與多種生化過程，特別是在糖代謝、氨基酸代謝、脂質代謝等過程。

2.5 辣椒素預處理對大鼠腦組織的代謝譜的影響 為了對下游數(shù)據(jù)進行更好的分析，我們對氣相色譜-質譜數(shù)據(jù)進行降噪過濾和間距范圍內標歸一化方法標準化處理，對標準化處理的數(shù)據(jù)進行模式識別多變量分析，將樣品名稱、峰值、歸一化的峰面積等信息導入SIMCA-P 13.0 軟件進行主成分分析(PCA)、偏最小二乘判別分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)，分析結果用得分圖(Score Plot)和載荷圖(Loading Plot)表示。

2.5.1 PCA結果 主成分分析PCA用來顯示原始數(shù)據(jù)樣品的總體分布，由得分圖可以看出，無論是假手術組和模型組還是模型組和辣椒素預處理組，樣本點基本可以明顯區(qū)分，可通過后續(xù)的判別分析進一步研究其差異(見圖4)。

2.5.2 PLS-DA結果 為了分離更高水平的分類變量，采用PLS-DA獲得數(shù)據(jù)(X變量)和其它變量(Y變量，分組信息)之間的相關關系，使用UV格式化處理的數(shù)據(jù)標度換算方式，對第一，二主成分進行建模分析。對模型的質量用7折交叉驗證進行檢驗，并用交叉驗證后得到的分類參數(shù)R2X 和Q2(分別代表模型可解釋的變量和模型的可預測度)對模型有效性進行評判。此后，通過排列實驗隨機多次(n=200)改變分類變量Y的排列順序得到相應不同的隨機Q2值對模型有效性做進一步的檢驗。模型累積解釋率見表2。

由PLA-DA得分圖如圖5、圖6所示(橫坐標為第1主成分得分，用t1表示；縱坐標為第2主成分得分，用t2表示)，PLS-DA得分圖如圖3所示。R2X(即模型的可解釋變量，見圖5B、6B綠色圓點)及R2Y(即監(jiān)督模型的解釋率，見圖5B、6B藍色矩形)接近1說明PLS-DA模型已經可以很好地解釋假手術組與模型組、模型組與辣椒素預處理組兩組樣本之間的差異(見圖5A、圖6A)。

2.5.3 OPLS-DA結果 對PLS-DA模型進行正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)，最大化地凸顯模型內部不同組別之間的差異，變量遠離原點越遠，表明差異貢獻越大。由圖7A可以看出，模型組偏離假手術組較遠，表明腦缺血損傷嚴重；圖7B可以看出，辣椒素預處理組與假手術組逐漸接近，表明藥物干預后對代謝網(wǎng)絡的調節(jié)起一定的作用，表明缺血損傷開始恢復。

我們采用第一主成分的VIP(Variable Importance in the Projection)值(VIP>1)，并結合t檢驗(t-test)的P值(P<0.05)來篩選差異性表達代謝物。各組大鼠腦組織樣本鑒定的內源性代謝物(見表3)，與假手術組大鼠相比，模型組大鼠的皮質代謝譜明顯不同，興奮性氨基酸谷氨酸(P<0.05)、肌醇(P<0.01)等代謝物出現(xiàn)顯著增高；花生四烯酸(P<0.01)、異亮氨酸(P<0.001)、甲硫氨酸(P<0.001)、L-半胱氨酸(P<0.001)、天冬氨酸(P<0.05)、苯丙氨酸(P<0.05)等氨基酸、1-磷酸-葡萄糖(P<0.05)、6-磷酸-葡萄糖(P<0.01)等糖代謝物出現(xiàn)顯著降低。

與模型組大鼠相比，辣椒素預處理組大鼠的皮質代謝譜明顯不同，異亮氨酸、蛋氨酸、L-半胱氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸等氨基酸恢復正常水平，2-丁酮酸(P<0.05)、3，5-二羥苯甘氨酸(P<0.001)、肌苷(P<0.01)等代謝物顯著增高。

表3 各組大鼠腦組織樣本鑒定的差異內源性代謝物

圖1 辣椒素預處理對腦梗死體積的影響

圖2 辣椒素預處理對大鼠神經功能缺損評分的影響

圖3 各組樣品的GC-MS總離子流圖

圖4A 假手術組和模型組代謝物的主成分分析得分圖

圖4B 模型組和辣椒素預處理組代謝物的主成分分析得分圖

圖5A 假手術組與模型組的PLS-DA的得分圖

圖5B 假手術組與模型組的PLS-DA的置換檢驗圖

圖6A 模型組與辣椒素預處理組的PLS-DA的得分圖

圖6B 模型組與辣椒素預處理組的PLS-DA的置換檢驗圖

圖7A 假手術組與辣模型組的OPLS-DA的得分圖

圖7B 模型組與辣椒素預處理組的OPLS-DA的得分圖

3 討 論

腦缺血再灌注損傷涉及一系列復雜的病理生理過程，主要包括能量代謝障礙、興奮性氨基酸毒性、細胞內鈣超載、氧自由基增多、內皮細胞損傷、凋亡基因激活、炎癥反應等多個環(huán)節(jié)[2～5]，各個環(huán)節(jié)之間相互聯(lián)系、相互作用，構成一個極為復雜的關系網(wǎng)絡，形成級聯(lián)反應，最終導致細胞的凋亡。

3.1 能量代謝障礙 正常生理條件下，腦組織主要通過葡萄糖有氧氧化途徑，在細胞線粒體中產生ATP供能[22]。而腦缺血再灌注時ATP合成減少說明腦組織能量代謝障礙，分析原因可能是：(1)腦缺血導致攜帶至腦組織的氧氣和葡萄糖相應減少，腦組織細胞缺氧，有氧代謝障礙，腦組織為了獲得能量，通過葡萄糖無氧酵解途徑生成ATP為大腦供能，導致合成ATP減少[23]。(2)ATP的前身物質減少：我們的實驗結果表明(見表3)，模型組與對照組相比，包括肌苷(P<0.01)、次黃嘌呤(P<0.05)等ATP的前身物質減少，可能因為在再灌注時前身物質被血流沖洗出去，導致總腺苷酸水平降低。而辣椒素預處理后，肌苷、次黃嘌呤水平恢復正常水平，有文獻報道補充外源性肌苷對缺血性腦組織起保護作用，促進神經功能恢復[24]，因此，再灌注后不僅腦組織恢復供血供氧，ATP合成逐漸恢復正常，辣椒素術前3 h預處理通過促進肌苷、次黃嘌呤等ATP合成前體物質表達水平恢復進而促進ATP的合成以保證對腦組織的供能。

3.2 谷氨酸的神經毒性作用 谷氨酸作為中樞神經系統(tǒng)含量最高、分布最廣、作用最強的興奮性神經遞質，正常情況下主要存在于神經末梢的突觸囊泡內，末梢去極化時釋放到突觸間隙，作用于突觸后膜的特異性受體，完成興奮性突觸傳遞及其它生理作用。腦缺血后，突觸間隙谷氨酸釋放增加或再攝取障礙導致其在突觸間隙堆積，從而過度興奮谷氨酸受體導致神經細胞的凋亡[25]。由表3可以看出，模型組與對照組相比，谷氨酸的含量顯著增加(P<0.05)，代表大腦有一定程度的損傷。辣椒素預處理后，谷氨酸恢復到正常水平(P>0.05)，表明辣椒素預處理能夠緩解從腦中釋放谷氨酸的量，對腦缺血損傷有保護作用。

腦缺血后，兩類谷氨酸受體被谷氨酸激活：離子通道受體(ionotropic，iGluRs)和代謝型受體(metabotropic，mGluRs)兩類，離子通道受體包括：N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)、α-氨基-3 羥基-5 甲基-4 異惡唑受體(AMPAR)和海人藻酸受體(KAR)，后兩者稱為非NMDA受體。興奮性谷氨酸神經遞質的神經毒性包括兩個明顯不同的過程：一是激活NMDA受體，直接或間接啟動電壓敏感性通道，Ca2+大量內流，造成遲發(fā)性的神經元變性壞死；二是作用于非NMDA受體，引起Na+、CL-內流，造成神經元急性水腫為特征的急性損傷。代謝型受體包括mGluR1-8共8個亞型，I組受體(mGluR1、mGluR5)激活后通過膜內G蛋白、磷脂酶C，引起三磷酸肌醇IP3和甘油二酯DAG的產生，導致胞內Ca2+的釋放。II組受體(mGluR2、mGluR3)和Ⅲ組受體(mGluR4、mGluR6、mGluR7和mGluR8)通過膜內G蛋白、腺苷酸環(huán)化酶，抑制cAMP的生成[26]。

目前針對谷氨酸神經毒性作用的神經保護劑多種多樣，分別從抑制谷氨酸的合成、釋放、提高清除谷氨酸的能力、谷氨酸受體抑制劑(NMDAR抑制劑、AMPAR受體抑制劑、KA受體抑制劑)、mGluR的調節(jié)、Na+/H+離子交換泵抑制劑、Ca2+內流抑制劑等角度減少谷氨酸的釋放或提高載體對谷氨酸的再攝取能力，起到缺血性腦損傷的神經保護作用[27]。越來越多的研究表明，代謝型受體mGluRs的調制在興奮性谷氨酸神經毒性作用中發(fā)揮重要作用[28～32]，尤其是I組mGluR存在多個藥物作用的位點發(fā)揮作用。有趣的是，我們的實驗結果發(fā)現(xiàn)，辣椒素預處理組與模型組相比，3，5-二羥苯甘氨酸(DHPG)的含量顯著提高(P<0.05)，DHPG作為代謝型谷氨酸受體mGluR1和mGluR5的選擇性激動劑，已有文獻表明低劑量3，5-二羥苯甘氨酸預處理對大腦中動脈缺血損傷提供神經保護作用，作用機制可能是通過激活I組mGluR，激活磷脂酶C，引起IP3和DAG的產生，導致胞內Ca2+釋放至胞漿抑制NMDA受體的內化從而提供神經保護作用[33]。因此我們推測辣椒素預處理對腦缺血損傷的保護作用機制可能是一方面緩解從腦中釋放興奮性谷氨酸的量，另一方面促進低劑量3，5-二羥苯甘氨酸的表達共同作用提供神經保護作用。

3.3 氧自由基的神經毒性作用 腦缺血后，通過花生四烯酸代謝和黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)活化等多個途徑產生大量自由基進而對細胞內的蛋白、脂質及核苷酸等成分產生神經毒性作用，造成神經細胞損傷[34]。氧自由基的神經毒性作用可概括為：(1)作用于多價不飽和脂肪酸，發(fā)生脂質過氧化；(2)誘導DNA、RNA、多糖和氨基酸等大分子物質交聯(lián)，交聯(lián)后的大分子則失去原來的活性或功能降低[35]。由表3可以看出，模型組與對照組相比，多不飽和脂肪酸花生四烯酸的含量顯著降低(P<0.01)，由于腦缺血后產生的大量自由基攻擊富含不飽和脂肪酸的神經膜與血管，生成脂質過氧化物和氫過氧化物，不飽和脂肪酸的丟失使得細胞結構的完整性破壞，膜的通透性、離子轉運、膜屏障功能均受到嚴重影響，從而導致細胞壞死。

3.4 激活腦內成體神經干細胞NSCs自我修復機制 在腦缺血時，腦內內源性神經干細胞NSCs可以增殖、遷移至損傷部位并分化進行修復。Nochi等人發(fā)現(xiàn)，腦缺血時，代謝型谷氨酸受體mGluR5信號通路可以參與神經干細胞的增殖過程[36，37]。因此我們推測，辣椒素預處理后，激活的代謝型谷氨酸受體mGluR5不僅參與清除興奮性谷氨酸的清除作用，還可能通過參與內源性神經干細胞的增殖加強神經干細胞的活化，對缺血再灌注腦損傷發(fā)揮保護作用。

綜上，在皮質缺血側組織中檢測到的代謝物，肌苷、次黃嘌呤、谷氨酸、3、5-二羥苯甘氨酸、花生四烯酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、L-半胱氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、1-磷酸-葡萄糖、6-磷酸-葡萄糖為腦缺血再灌注損傷后皮質組織中潛在的標志性代謝物。通過辣椒素預處理可不同程度回調肌苷、次黃嘌呤、花生四烯酸、異亮氨酸、蛋氨酸、L-半胱氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、1-磷酸-葡萄糖、6-磷酸-葡萄糖水平。辣椒素預處理可能是通過改善對缺血腦組織的能量代謝障礙，緩解興奮性谷氨酸的釋放量，增強皮質組織神經元的活性、修復和改善生物膜的功能、促進內源性神經干細胞的增殖對缺血再灌注腦損傷發(fā)揮保護作用。氣相色譜質譜技術能較為全面地反映生物體在藥物干預作用下的代謝狀態(tài)變化，并能通過代謝物含量的差異推斷藥物的作用機制，為研究腦缺血損傷機制和治療腦缺血藥物尋找新的靶標。

[1]Kristián K，Siesj BK. Calcium in ischemic cell death[J]. Stroke，1998，29(29)：705-718.

[2]Atsushi S，Carolina MM，Purnima N，et al. Oxidative stress and neuronal death/survival signaling in cerebral ischemia[J]. Mol Neurobiol，2005，31：105-116.

[3]Atsuko K，Luca S. Mitochondria：from cell death executioners to regulators of cell differentiation[J]. Trends in Cell Biology，2014，24(12)：761-770.

[4]Dziedzic T. Systemic inflammation as a therapeutic target in acute ischemic stroke[J]. Expert Rev Neurother，2015，15(5)：523-531.

[5]Suzuki Y，Nagai N，Umemura K. A review of the mechanisms of blood-brain barrier permeability by tissue-type plasminogen activator treatment for cerebral ischemia[J]. Front Cell Neurosci，2016，10：2.

[6]PedersenSF，Owsianik G，Nilius B. TRP channels：an overview[J]. Cell Calcium，2005，38(3/4)：233-252.

[7]Zhang MJ，Yin YW，Li BH，et al. The role of TRPV1 in improving VSMC function and attenuating hypertension[J]. Prog Biophys Mol Biol，2015，117(2/3)：212-216.

[8]Deng Y，Huang X，Wu H，et al. Some like it hot：the emerging role of spicy food (capsaicin) in autoimmune diseases[J]. Autoimmun Rev，2016，15(5)：451-456.

[9]Madasu MK，Roche M，F(xiàn)inn DP. Supraspinal Transient Receptor Potential Subfamily V Member 1 in Pain and Psychiatric Disorders[J]. Mod Trends Pharmacopsychiatri，2015，30：80-93.

[10]Nicholson JK，Wilson ID. Opinion：understanding’global’ systems biology：metabonomics and the continuum of metabolism[J]. Nat Rev Drug Discov，2003，2(8)：668-676.

[11]Brindle JT，Antti H，Holmes E，et al. Rapid and noninvasive diagnosis of the presence and severity of coronary heart disease using 1H-NMR-based metabonomics[J]. Nat Med，2002，8(12)：1439-1444.

[12]M?kinen VP，Soininen P，F(xiàn)orsblom C，et al. 1H NMR metabonomics approach to the disease continuum of diabetic complications and premature death[J]. Mol Syst Biol，2008，4：167.

[13]McPhail MJ，Shawcross DL，Lewis MR，et al. Multivariate metabotyping of plasma accurately predicts survival in patients with decompensated cirrhosis[J]. J Hepatol，2016，64(5)：1058-1067.

[14]Kumar A，Ghosh D，Singh RL. Amyotrophic lateral sclerosis and metabolomics：clinical implication and therapeutic approach[J]. Biomark，2013，2013：538765.

[15]Jové M，Portero-Otín M，Naudí A，et al. Metabolomics of human brain aging and age-related neurodegenerative diseases[J]. Neuropathol Exp Neurol，2014，73(7)：640-657.

[16]Kang J，Zhu L，Lu J，et al. Application of metabolomics in autoimmune diseases：insight into biomarkers and pathology[J]. Neuroimmuno，2015，15，279：25-32.

[17]Khatibi NH，Jadhav V，Charles S，et al. Capsaicin pre-treatment provides neurovascular protection against neonatal hypoxic-ischemic brain injury in rats[J]. Acta Neurochir Suppl，2011，111：225-230.

[18]Balzan SM，Gava VG，Rieger A，et al. Ischemic versus pharmacologic hepatic preconditioning[J]. Surg Res，2014，191：134-139.

[19]Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke，1989，20(1)：84-91.

[20]Bederson JB，Pitts LH，Tsuji M，et al. Rat middle cerebral artery occlusion：evaluation of the model and development of a neurologic examination[J]. Stroke，1986，17(3)：472-476.

[21]Meng JR，Zhang XD，Wu H，et al. Morphine-induced conditioned place preference in mice：Metabolomic profiling of brain tissue to find “molecular switch” of drug abuse by gas chromatography/ mass spectrometry[J]. Analytica Chimica Acta，2012，710：125-130.

[22] Schagger H，Pfeiffer K. The ratio of oxidative phosphorylation complexes I-V in bovine heart mitochondria and the composition of respiratory chain supercomplexes[J]. J Biol Chem，2001，276：37861-37867.

[23]Sims NR，Anderson MF. Mitochondrial contributions to tissue damage in stroke[J]. Neurochem Int，2002，40：511-526.

[24]李 琴，畢明俊，張 紅，等. 肌苷對腦缺血再灌注后VEGF表達的影響[J]. 齊魯醫(yī)學雜志，2004，19(1)：21-26.

[25]Wang Y，Qin ZH. Molecular and cellular mechanisms of excitotoxic neuronal death[J]. Apoptosis，2010，15(11)：1382-1402.

[26]Fabio B，Annarosa U. Group I metabotropic glutamate receptors：implications for brain disease[J]. Progress in Neurobiol，1999，59：55-79.

[27]Kostandy BB. The role of glutamate in neuronal ischemic injury：the role of spark in fire[J]. Neurologic Sci，2012，33(2)：223-237.

[28]Koh JY，Palmer E，Cotman CW. Activation of the metabotropic glutamate receptor attenuates N-methyl-D-aspartate neurotoxicity in cortical cultures[J]. PNAS，1991，88：9431-9435.

[29]Bao WL，Williams AJ，F(xiàn)aden AI，et al. Selective mGluR5 receptor antagonist or agonist provides neuroprotection in a rat model of focal cerebralischemia[J]. Brain Res，2001，20；922(2)：173-179.

[30]Bond A，Ragumoorthy N，Monn JA，et al. LY379268，a potent and selective Group II metabotropic glutamate receptor agonist，is neuroprotective in gerbilglobal，but not focal，cerebral ischaemia[J]. Neurosci Lett，1999，8，273(3)：191-194.

[31]Sabelhaus CF，Schr?der UH，Breder J，et al. Neuroprotection against hypoxic/hypoglycaemic injury after the insult by the group Ⅲ metabotropic glutamatereceptor agonist (R，S)-4-phosphonophenylglycine[J]. Br J Pharmacol，2000，131(4)：655-658.

[32]Kohara A，Takahashi M，Yatsugi S，et al. Neuroprotective effects of the selective type 1 metabotropic glutamte receptor antagonist YM-202074 in rat stroke models[J]. Brain Res，2008，29(1191)：168-179.

[33]Nik Ramli NN，Siran R. The neuroprotective effects of (S)-3，5-dihydroxyphenylglycine preconditioning in middle cerebral artery occluded rats：a perspective as a contrivance for stroke[J]. Neural Regen Res，2015，10(8)：1221-1222.

[34]Abramov AY，Scorziello A，Duchen MR. Three distinct mechanisms generate oxygen free radicals in neurons and contribute to cell death during anoxia and reoxygenation[J]. J Neurosci，2007，27(5)：1129-1138.

[35]Wang PR，Wang JS，Zhang C，et al. Decotion induced protective autophagy against the injury of cerebral ischemia/reperfusion via MAPK-mTOR signaling pathway[J]. Ethnopharmacol，2013，26，149(1)：270-280.

[36]Nochi R，Kato T，Kaneko J，et al. Involvement of metabotropic glutamate receptor 5 signaling in activity-related proliferation of adult hippocampal neural stem cells[J]. Eur J Neurosci，2012，36(3)：2273-2283.

[37]Zhao L，Jiao Q，Chen X，et al. mGluR5 is involved in proliferation of rat neural progenitor cells exposed to hypoxia with activation of mitogen-activated protein kinase signaling pathway[J]. J Neurosci Res，2012，90(2)：447-460.

Neuroprotective effects of capsaicin pretreatment on ischemic stroke rats revealed by metabolomic approach

ZHANG Yi，ZHU Desheng，WANG Yan.

(Institute of Cerebrovascular Disease，Shanghai 201203，China)

Objective The purpose of this study is to elucidate the neuroprotective effects of capsaicin pretreatment on ischemic stroke rats revealed by GC-MS metabolomicapproach. Methods The establishment of middle cerebral artery occlusion is a ideal method to mimic cerebral ischemia reperfusion injury. Twenty-four adult SD rats were randomly divided into three groups：sham group (Sham)，model group (Mod) and capsaicin pretreatment group (CAP，0.2 mg/Kg). The cerebral cortex tissues were collected using GC-MS metabolomic approach and the screening of differential expressed metabolites were adopted by multivariate statistical analyses including PCA analysis，partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) and orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA). Results OPLS-DA score plot can obviously distinguish each group and the screening methods of differentially expressed metabolites were according to the VIP value and the loading scatter plot combined with t-test (P<0.05). The analytical results showed that the metabolism spectrum in model group was different from sham group，excitatory amino acid glutamic acid (P<0.05) metabolites were significantly increased while arachidonic acid(P<0.01)and some amino acid such as isoleucine(P<0.001)，methionine(P<0.001)，L-cysteine(P<0.001)，aspartic acid(P<0.05)，phenylalanine(P<0.05) and energy metabolites such as 1-phosphate-glucose(P<0.05)、6-phosphate-glucose(P<0.01)significantly decreased. Compared with model group，the metabolism spectrum of capsaicin pretreatment group represents a distinct metabolism spectrum，inosine，isoleucine，methionine，L-cysteine，aspartic acid，phenylalanine and other amino acids were approaching to normal levels，3，5-dihydroxy phenyl glycine (P<0.001) and other metabolites significantly increased. Conclusion These differentially expressed metabolites are related to the disturbance in energy metabolism，glycometabolism. Capsaicin pretreatment may improve energy metabolism，alleviate the release of excitatory glutamate，improve the biological function of membrane to provide the neuroprotective effects. In summery，GC-MS metabolomic approach can comprehensively reflect the general metabolic changes under the drug intervention and explore the underlying mechanism，which is helpful to further understanding the therapeutical mechanism of cerebral ischemia reperfusion injury.

TRPV1； Capsaicin； Cerebral ischemia reperfusion injury； Metabonomics

1003-2754(2016)11-0987-08

2016-03-15；

2016-09-15

上海市自然科學基金(No. 14ZR1436700)；上海市衛(wèi)計委科研課題(No. 20144Y0225，No. 201440347)

(上海市腦血管病防治研究所，上海 201203)

王 艷，E-mail：wangyan1997@aliyun.com

R743

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