二氫楊梅素對(duì)小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷炎癥反應(yīng)的影響

鄧之婧， 陳家歡， 黃志明， 黃曉亮， 龐逸敏， 郭 哲， 何 萍

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二氫楊梅素對(duì)小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷炎癥反應(yīng)的影響

鄧之婧1， 陳家歡1， 黃志明1， 黃曉亮1， 龐逸敏1， 郭 哲2， 何 萍3

目的 觀察二氫楊梅素(dihydromyricetin，DMY) 對(duì)小鼠局灶性腦缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷后炎癥反應(yīng)的影響。方法 雄性昆明種小鼠隨機(jī)分為3組，即假手術(shù)組、I/R模型組及DMY(500 mg/kg)組。改良線栓法制備小鼠大腦中動(dòng)脈阻塞/再灌注(middle cerebral artery occlusion / reperfusion，MCAO/R)局灶性腦缺血(3 h)再灌注(24 h)損傷模型。術(shù)前10 d開(kāi)始灌胃給藥，每天1次，并在缺血前1 h及再灌注后12 h各給藥1次。再灌注24 h后取腦，免疫組織化學(xué)檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物離子鈣接頭蛋白 (ionized calcium binding adaptor molecule-1，Iba1)和5-脂氧合酶(5-lipoxygenase，5-LOX)表達(dá)；ELISA法檢測(cè)缺血腦組織勻漿炎癥因子TNF-α和5-LOX代謝物白三烯B4(leukotrienes B4，LTB4)、半胱氨酰白三烯(cysteinyl leukotrienes，CysLTs)含量。結(jié)果 與模型組比較，DMY 500 mg/kg抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化并降低TNF-α水平，降低缺血腦組織5-LOX蛋白表達(dá)并減少LTB4與CysLTs的產(chǎn)生(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論 DMY可減輕局灶性腦I/R損傷炎癥反應(yīng)，與抑制5-LOX有關(guān)。

二氫楊梅素； 腦缺血再灌注損傷； 炎癥反應(yīng)； 5-脂氧合酶

炎癥反應(yīng)是缺血性腦損傷的重要病理生理學(xué)機(jī)制之一，腦缺血損傷后的炎癥反應(yīng)是腦缺血后組織持續(xù)損傷的重要原因[1]。5-脂氧合酶(5-lipoxygenase，5-LOX)及其代謝產(chǎn)物白三烯物質(zhì)如白三烯B4(leukotrienes B4，LTB4)和半胱氨酰白三烯(cysteinyl leukotrienes，CysLTs)在炎癥反應(yīng)介導(dǎo)缺血性腦損傷的過(guò)程中起重要作用[2]。本課題組前期研究表明，二氫楊梅素 (Dihydromyricetin，DMY)對(duì)小鼠局灶性腦缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷具有保護(hù)作用，保護(hù)機(jī)制與其抗氧化作用有關(guān)[3]。本研究觀察DMY 對(duì)小鼠局灶性腦I/R損傷后5-LOX和炎癥反應(yīng)的影響，以進(jìn)一步探討其保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)健康雄性昆明種小鼠，體質(zhì)量25～30 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK桂2014-0002。

1.2 主要藥品與試劑 DMY(西安開(kāi)來(lái)生物工程有限公司，純度98.33%，批號(hào)K130311)，臨用前用0.5%羧甲基纖維素鈉配置成50 mgoml-1混懸液；異氟烷(瑞沃德生命科技有限公司，批號(hào)217151201)；兔抗鼠5-LOX多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz)；兔抗鼠離子鈣接頭蛋白)(ionized calcium-binding adaptor molecule 1，Iba1)多克隆抗體標(biāo)記小膠質(zhì)/巨噬細(xì)胞(日本W(wǎng)ako)；SP免疫組織化學(xué)二抗試劑盒(北京中杉)；LTB4、CysLTs酶聯(lián)免疫試劑盒(上海江萊生物)，TNF-α 酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢博士德)。

1.3 主要儀器設(shè)備 R580小動(dòng)物麻醉機(jī)(瑞沃德生命科技有限公司)；XTZ-D解剖顯微鏡(上海光學(xué)五廠)；DMR+Q550病理圖像分析儀(德國(guó)Leica)；酶標(biāo)儀(Molecular Devices)。

1.4 動(dòng)物分組與給藥 42只小鼠隨機(jī)分為3組，即假手術(shù)組、I/R模型組及DMY(500 mg/kg)組，每組14只。DMY組在造模前10 d持續(xù)灌胃50 mg/ml DMY 10 ml/kg，每天1次，并在缺血前1 h及再灌注后12 h各給藥1次；I/R模型組和假手術(shù)組同期灌胃等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉。

改良線栓法建立小鼠大腦中動(dòng)脈阻塞/再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R)局灶性腦I/R損傷模型[4]。異氟烷吸入性麻醉后，分離結(jié)扎I/R模型小鼠左頸總動(dòng)脈，在結(jié)扎處上方剪一小口，插入直徑0.20～0.23 mm的線栓，輕輕將線栓推進(jìn)至大腦中動(dòng)脈起始處，進(jìn)線距頸總動(dòng)脈分叉約0.8～0.9 cm，結(jié)扎固定栓線。缺血3 h后，再次異氟烷吸入性麻醉，小心拔出栓線并結(jié)扎頸總動(dòng)脈殘端，再灌注24 h。假手術(shù)組只分離結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈，不插入線栓。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè)Iba1與5-LOX蛋白表達(dá) 再灌注24 h后，每組選小鼠6只，4%多聚甲醛全身灌注后取腦后固定24 h，取視交叉后1～4 mm腦塊進(jìn)行石蠟包埋，4 μm連續(xù)冠狀面切片。常規(guī)HE染色后，光鏡下觀察腦組織病理改變；同時(shí)按試劑說(shuō)明書以SP法進(jìn)行Iba1和5-LOX免疫組織化學(xué)染色。在每只小鼠皮質(zhì)缺血灶隨機(jī)取4個(gè)相互不重疊的400×高倍鏡視野，計(jì)數(shù)其中的陽(yáng)性產(chǎn)物面積。

1.6 酶聯(lián)免疫檢測(cè)缺血腦組織TNF-α和LTB4、CysLTs的含量 再灌注24 h后，每組另取小鼠8只，取小鼠缺血側(cè)腦組織進(jìn)行勻漿，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明分別測(cè)定腦組織勻漿中TNF-α和LTB4、CysLTs的含量。

2 結(jié) 果

2.1 DMY對(duì)小鼠缺血腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響 見(jiàn)圖1，小鼠腦缺血再灌注24 h后，缺血周邊區(qū)出現(xiàn)Iba1陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞。模型組缺血周邊區(qū)Iba1陽(yáng)性產(chǎn)物面積(865.15±133.94 μm2/HP)，較假手術(shù)組(41.03± 13.48 μm2/HP)明顯增多(P<0.01)。與I/R模型組相比，DMY明顯降低缺血腦組織Iba1 (618.48±101.57 μm2/HP)的表達(dá)(P<0.01)。

2.2 DMY對(duì)小鼠缺血腦組織5-LOX表達(dá)的影響 見(jiàn)圖2，小鼠腦缺血再灌注24 h后，5-LOX陽(yáng)性產(chǎn)物主要表達(dá)在缺血周邊區(qū)。I/R模型組缺血周邊區(qū)5-LOX陽(yáng)性產(chǎn)物面積(1269.28± 214.33 μm2/HP)，比假手術(shù)組5-LOX陽(yáng)性產(chǎn)物面積(28.61± 8.56 μm2oHP-1)顯著增高(P<0.01)。與I/R模型組相比，DMY明顯降低缺血腦組織5-LOX的表達(dá)(634.61±135.56 μm2oHP-1)(P<0.01)。

2.3 DMY對(duì)小鼠缺血腦組織TNF-α與LTB4、CysLTs含量的影響 與假手術(shù)組比較，I/R模型組小鼠缺血側(cè)腦組織TNF-α與LTB4、CysLTs含量均明顯升高(均P<0.01)。與I/R模型組比較，DMY組降低小鼠缺血腦組織TNF-α與LTB4、CysLTs含量(P<0.05或P<0.01)(見(jiàn)表1)。

表1 DMY對(duì)腦I/R損傷小鼠缺血腦組織TNF-α與LTB4、CysLTs含量的影響

與假手術(shù)組比較，##P<0.01；與I/R模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖1 小鼠缺血腦組織Iba1表達(dá)(×400)

圖2 小鼠缺血腦組織5-LOX表達(dá)(×400)

3 討 論

二氫楊梅素是我國(guó)廣西和湖南省的壯族、瑤族民間習(xí)用草藥藤茶的主要黃酮類成分，含量高達(dá)27%左右，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎等多種藥理活性，且毒性小，近年來(lái)引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的極大關(guān)注[5]。本課題組前期研究表明，DMY 500 mg/kg降低小鼠局灶性腦I/R損傷后神經(jīng)功能損傷缺損評(píng)分、腦梗死體積和腦含水量，對(duì)局灶性腦I/R損傷具有保護(hù)作用[3]。

腦I/R損傷是一個(gè)復(fù)雜的級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程，涉及多種機(jī)制，其中腦損傷后炎癥反應(yīng)在缺血性腦卒中的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中具關(guān)鍵作用，抗炎治療能有效減輕缺血性腦損傷，并有較寬的時(shí)間治療窗[1]。腦缺血損傷后有大量炎性細(xì)胞因子表達(dá)和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，引起一系列炎癥反應(yīng)，其過(guò)度表達(dá)可加重腦組織損傷。小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)主要的炎癥效應(yīng)細(xì)胞，在正常腦組織中處于休眠狀態(tài)，腦缺血發(fā)生后，小膠質(zhì)細(xì)胞迅速活化增殖，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可分泌細(xì)胞毒性分子如一氧化氮、活性氧和促炎因子如TNF-a和IL-1β等，引起神經(jīng)元損傷[6]。本研究中，DMY500 mg/kg可抑制小鼠缺血腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞活化并減少TNF-a產(chǎn)生，表明DMY對(duì)局灶性腦I/R損傷后炎癥反應(yīng)具有抑制作用。

5-LOX是催化花生四烯酸(Arachidonic acid，AA)代謝生成白三烯的關(guān)鍵酶。白三烯是重要的炎癥介質(zhì)，在腦缺血、腦外傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病中起重要作用。其中，LTB4是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的白細(xì)胞趨化因子和化學(xué)激動(dòng)因子，使血管通透性增高，血漿滲出，并使白細(xì)胞向炎癥區(qū)聚集，介導(dǎo)腦缺血部位的炎性反應(yīng)；LTB4 還可刺激單核/巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞合成和釋放IL-1β、TNF-α和IL-5等細(xì)胞因子，進(jìn)一步激活炎癥反應(yīng)[2]。CysLTs是很強(qiáng)的炎癥介質(zhì)，介導(dǎo)平滑肌痙攣、微血管滲漏等，增加血腦屏障通透性和促進(jìn)腦水腫形成。多種5-LOX抑制劑(如AA861、去甲二氫愈創(chuàng)木酸NDGA、齊留通、米諾環(huán)素、咖啡酸等)[7～10]等對(duì)缺血性腦損傷具有保護(hù)作用。研究報(bào)道DMY能顯著抑制由蛋白胨引起的腹腔炎癥大、小鼠中性粒細(xì)胞釋放LTB4及LTC4[11]。本研究中，腦I/R損傷導(dǎo)致缺血腦組織5-LOX表達(dá)及其代謝產(chǎn)物L(fēng)TB4與CysLTs明顯增加；DMY 500 mg/kg可抑制缺血腦組織5-LOX表達(dá)并減少其代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，對(duì)缺血腦組織5-LOX具有抑制作用。

綜上所述，DMY可減輕局灶性腦I/R損傷后炎癥反應(yīng)，其抗炎機(jī)制與抑制5-LOX、減少5-LOX代謝產(chǎn)物有關(guān)。DMY作為一種高效、低毒、價(jià)格低廉的中藥活性成分，有望成為新型的抗缺血性腦血管病的藥物。

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Dihydromyricetin Reduces Inflammatory Reaction Induced by Focal Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury in Mice

DENG Zhijing，CHENG Jiahuan，HUANG Zhiming，et al.

(Pharmaceutical College of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China)

Objective To study the influences of dihydromyricetin (DMY) on inflammatory reaction induced by focal cerebral ischemia-reperfusion (I/R) injury in mice. Methods Male Kunming mice were randomly divided into 3 groups：sham group，I/R group and DMY 500 mg/kg group. Mice model of middle cerebral artery occlusion (MCAO，3 h)/reperfusion (24 h) model was established by the improved intraluminal filament technique. Drugs were given orally 10 d(once a day)before the surgery，1 h before ischemia and 12 h after reperfusion. After reperfusion for 24 h，the expressions of ionized calcium binding adaptor molecule-1(Iba1) and 5-LOX in mice brain were assessed by immunohistochemistry；the contents of TNF-αand 5-LOX metabolites (LTB4 and CysLTs ) in ischemic brain tissue were detected by ELISA. Results Compared with the I/R group，DMY at 500 mg/kg could obviously inhibit the activation of microglia，lower the level of TNF-α，and reduce the expression of 5-LOX and the production of LTB4 and CysLTs (P<0.05或P<0.01). Conclusion DMY reduces inflammatory reaction induced by focal cerebral I/R injury，which might be associated with its inhibition on 5-LOX.

Dihydromyricetin； Cerebral ischemia-reperfusion injury； Inflammatory reaction； 5-Lipoxygenase

1003-2754(2016)11-0973-03

2016-07-20；

2016-09-17

國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 81360056)；廣西自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No. 2013GXNSFAA019147)；廣西自然科學(xué)基金回國(guó)基金項(xiàng)目(No. 2012GXNSFCA053005)；南寧市科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)計(jì)劃(No. 20153105)

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530021；3.廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣西 南寧 530021)

郭 哲，E-mail：guozhe2301@163.com；何 萍，E-mail：hpnngxmu@163.com

R966；R743

A