改良Gallyas-Braak嗜銀染色在阿爾茨海默氏病中的應用

曹莉 曹穎 文安智 官志忠

(1．水城礦業集團總醫院病理科，貴州 六盤水 553001； 2．貴州省人民醫院病理科,貴州 貴陽 550002；3．貴州醫科大學病理教研室，貴州 貴陽 550004 )

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改良Gallyas-Braak嗜銀染色在阿爾茨海默氏病中的應用

曹莉1曹穎2△文安智2官志忠3

(1．水城礦業集團總醫院病理科，貴州 六盤水 553001； 2．貴州省人民醫院病理科,貴州 貴陽 550002；3．貴州醫科大學病理教研室，貴州 貴陽 550004 )

阿爾茨海默病； 改良Gallyas-Braak嗜銀染色； 老年斑； 神經原纖維纏結

中樞神經系統變性疾病是一組原因不明、具有選擇性神經元和膠質細胞變性特征的疾病，包括阿爾茨海默病(AD)、多系統萎縮、Pick病及進行性核上性麻痹等。這些變性疾病有各自特殊的組織學病變，需經特殊嗜銀染色或相應蛋白的免疫組織化學染色才能顯示。國外多采用修訂的Gallyas-Braak嗜銀染色方法代替傳統的Bodian或Bielschowsky嗜銀染色方法顯示AD 腦組織中神經細胞外老年斑(SP)、神經細胞內神經原纖維纏結(NFTs)、膠質細胞胞漿內包涵體等改變[1-2]。近年來國內對該方法也逐漸引起重視[3-4]。我們參照文獻[3]在AD患者尸解腦標本中進行了檢測并做了進一步的改進，取得了良好的效果，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 AD患者及老年同齡對照者尸體解剖后腦海馬組織標本由荷蘭Amsterdam 腦庫提供。其中AD患者10例，男性3例，女性7例，平均年齡為(81.8±7.3)歲，經美國國立神經病語言障礙卒中研究所和阿爾茨海默病及相關疾病協會(NINCDS-ADRDA)診斷標準及病理學診斷標準確診AD，死后尸體解剖平均延遲時間為(4.9±1.1) h；老年同齡對照者8例，男性4例，女性4例，平均年齡為(79.8±12.8)歲，經臨床和病理學診斷排除神經系統疾患，死后尸體解剖平均延遲時間為(7.1±2.8) h。腦組織固定于中性甲醛液，脫水后石蠟包埋，分別制作4 μm及8 μm石蠟切片待下一步檢測。

1.2 試劑 Gallyas-Braak 嗜銀染色試劑購于北京化學試劑公司；鼠抗Aβ1-42單克隆抗體、兔抗PHF-1多克隆抗體及EnVision檢測試劑盒分別購于Dako、Sternberger及Dako公司。

1.3 Gallyas-Braak 嗜銀染色試劑原液配制 (1)硝酸鑭液：將0.5 g硝酸鑭、2 g醋酸鈉加入100 mL蒸餾水；(2) 堿性碘化銀液：將4 g氫氧化鈉、10 g碘化鉀加入50 mL蒸餾水中，攪拌至清亮，加入1% 的硝酸銀3.5 mL，大力攪拌待沉淀消失，加蒸餾水將體積調至100 mL；(3) 顯影原液 I∶50 g無水碳酸鈉加入1 000 mL蒸餾水中；顯影原液Ⅱ：依次將2 g硝酸銨、2 g硝酸銀、10 g硅鎢酸加入1 000 mL蒸餾水；顯影原液Ⅲ：依次將2 g硝酸銨、2 g硝酸銀、10 g硅鎢酸、6.1 mL 40%的甲醛溶液加入1 000 mL蒸餾水中。將配置好的顯影原液Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ保存在黑色瓶中。使用前現取適量顯影原液 Ⅱ 加入等量顯影原液Ⅰ中，劇烈攪拌，再加入等量顯影液 Ⅲ，劇烈攪拌至澄清。

1.4 改良Gallyas-Braak 嗜銀染色步驟 (1) 8 μm 厚石蠟切片脫蠟至水洗；(2) 0.3%高錳酸鉀液 10 min，自來水沖洗后蒸餾水沖洗；(3) 1% 草酸液 1 min，自來水沖洗后蒸餾水沖洗；(4) 硝酸鑭液 1 h，蒸餾水洗 3 次，5 min/次；(5) 堿性碘化銀液 37℃ 溫箱孵育45 min，1% 醋酸洗 3 次，1 min/次；(6) 顯影液顯影約20～30 min，觀察切片變成淡棕色停止； (7) 1% 醋酸洗3 次，1 min/次；(8) 0.5% 氯化金溶液30 s～2 min，蒸餾水沖洗；(9) 1% 硫代硫酸鈉溶液固定 1 min，水洗10 min；(10) 乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.5 Aβ1-42、PHF-1免疫組化學染色步驟 Aβ1-42、PHF-1免疫組織化學染色4 μm厚石蠟切片行Aβ1-42、PHF-1免疫組織化學組化染色，采用EnVision二步法，按照說明書進行操作，一抗Aβ1-42及PHF-1工作濃度分別為1∶50及1∶100， PBS替代一抗作陰性對照。

1.6 SP及及NFTs計數方法[5]于40倍顯微鏡視野下，對10例AD患者腦海馬CA4、CA3及CA1區1 mm×1 mm 的鏡下劃線方格內的 SP 及 NFTs 計數，每張切片數10個視野，最后得出每個部位SP及NFTs每平方毫米平均數 (個/mm2)。

2 結 果

2.1 改良Gallyas-Braak 嗜銀染色 AD患者與老齡對照者正常神經細胞、神經纖維、膠質細胞均不顯色，10 例AD患者海馬組織見棕褐色SP結構(圖1A)，彌散斑和經典斑均可見，神經細胞內見棕黑色NFTs (圖1B)，8例老齡對照者中3例見少量SP，均為彌散斑；8例均未見NFTs。

2.2 Aβ1-42及PHF-1免疫組織化學染色 10例AD患者海馬組織出現較多細胞外SP(圖1C)及細胞內NFTs (圖1D)。3例老齡對照者出現少量 SP，均為彌散斑；8例對照者均未見NFTs。

注：A．改良Gallyas-Braak嗜銀染色顯示SP(×200倍)；B. 改良Gallyas-Braak 嗜銀染色顯示NFTs(×200倍)；C. Aβ1-42免疫組化染色顯示SP(EnVision×200倍);D.PHF-1免疫組化染色顯示NFTs(EnVision×200倍)。圖1 AD患者海馬組織CA1區SP及NFTs

2.3 SP、NFTs計數 經改良Gallyas-Braak 嗜銀染色顯示SP、NFTs 數量與Aβ1-42、PHF-1免疫組織化學染色顯示SP、NFTs 數量大致相同，但改良Gallyas-Braak 嗜銀染色較免疫組化染色方法顯示SP和NFTs 數量稍少。AD組腦組織中SP、NFTs計數結果見表1。

表1 AD組腦組織中SP和NFTs計數個/mm2]

3 討 論

嗜銀染色基本原理是將固定后的切片浸染于銀溶液中，再用還原劑處理，使銀顆粒沉著于組織中呈現深棕色或黑色。與傳統 Bodian 或 Bielschowsky 嗜銀染色法不同，Gallyas-Braak 嗜銀染色法在浸銀前先使用硝酸鑭浸泡組織片，不顯示正常的神經組織結構，只有異常的嗜銀細胞結構才能被顯影，有利于觀察異常結構。

我們按照文獻[3]行Gallyas-Braak嗜銀染色，但在AD患者腦組織中無法觀察到SP、NFTs，延長物理顯影時間，仍不能見到SP、NFTs，且整張切片背景較淡。推測是否為堿性碘化銀液常溫浸銀1 min，不能有效地將銀顆粒沉著于組織中。針對該種情況，我們采用退行性染色方法進行染色，即現將組織深染，使其超過所需程度，然后再用分化劑退掉不該著色部分，使該著色部分達到適宜程度。我們對浸銀時間和溫度進行了改進，選用37 ℃溫箱內堿性碘化銀液避光孵育1 h，保證銀顆粒已沉著于組織中后，再利用分化劑氯化金溶液進行調色，在顯影液中顯影約20～30 min，密切觀察切片變成淡棕色時立即停止顯影。經改良后的Gallyas-Braak 嗜銀染色能清楚地顯示 AD 患者腦組織中的 SP、NFTs，彌散型SP和經典型SP均可見，且背景較干凈，有助結果的判定。

我們還對該批標本同期進行了Aβ1-42及PHF-1免疫組化染色并與改良Gallyas-Braak 嗜銀染色結果進行對比。結果顯示，改良Gallyas-Braak 嗜銀染色法和Aβ1-42、PHF-1免疫組化染色均可顯示細胞外SP及細胞內NFTs，免疫組化染色更為敏感，顯示的SP及NFTs數量較改良Gallyas-Braak 嗜銀染色稍多，背景更為清晰。但免疫組化試劑昂貴，操作較復雜，Gallyas-Braak嗜銀染色試劑便宜，染色方法簡便，與Aβ1-42及PHF-1蛋白免疫組化染色結果基本一致，對某些神經系統變性疾病的病理診斷和研究有很大的幫助,值得開展應用。

在染色應用時體會：(1)為取得良好的染色效果，染色劑硝酸鑭液和堿性碘化銀液應是新近配制，顯影液使用前現用現配。(2)由于腦組織含水分較多，且銀染色需要石蠟切片較厚(約8 μm，較易顯示軸、樹突)，提高銀染液的溫度，雖然有助于銀顆粒沉著，但嗜銀染色時間相對較長，很容易掉片，試驗中我們分別采用37 ℃溫箱內堿性碘化銀液避光孵育15 min，30 min，45 min及1 h等不同孵育時間，結果顯示，孵育15 min和30 min，經典SP可顯示，但較小的彌散SP不易顯示；而孵育1 h組織容易掉片；孵育45 min不易掉片，且可染出較小的彌散斑，與免疫組化結果較為一致；(3)氯化金溶液調色及物理顯影時間影響異常嗜銀結構的陽性率和正常背景結構著色的抑制程度，需密切觀察并掌握好顯影時間。

[1] Koichi Inoue, Haruhito Tsutsui, Hiroyasu Akatsu, et al. Metabolic profiling of Alzheimer's disease brains[J]. Sci Rep, 2013,3:2364.

[2] Keiko Nakamura,Fumiaki Mori,Tomoya Kon, et al. Filamentous aggregations of phosphorylated α-synuclein in Schwann cells (Schwann cell cytoplasmic inclusions) in multiple system atrophy[J].Acta Neuropathol Commun,2015,3: 29.

[3] 朱明偉,王魯寧,張笑明.Gallyas-Braak銀染色方法在神經組織病變中的應用[J]. 中華病理學雜志, 2001,30(5):384-385.

[4] 朱明偉, 王魯寧, 劉佳, 等. 神經系統變性疾病的脊髓病理觀察[J].中華病理學雜志, 2015, 41(8): 587-593.

[5] 劉東戈,吳浩強,滿開泉,等.阿爾茨海默病患者腦組織病理形態學及β-淀粉樣蛋白免疫組織化學觀察[J].中華病理學雜志,1999,28(6):405-408.

·經驗交流·

國家自然科學基金(81260173)

R749.1+6

B

1000-744X(2016)09-0928-02

2016-04-21)

△通信作者，E-mail：caoying0417@163.com