多指標優選補氣生血口服液水提醇沉工藝*

陳 璐，李晉奇，邊 原，胡 遠

四川省醫學科學院·四川省人民醫院，四川 成都 610072

多指標優選補氣生血口服液水提醇沉工藝*

陳 璐，李晉奇，邊 原，胡 遠

四川省醫學科學院·四川省人民醫院，四川 成都 610072

目的:采用多指標控制，通過正交實驗設計優化補氣生血口服液的水提醇沉工藝。方法:以當歸揮發油得率為指標，采用正交實驗篩選出當歸提取芳香水的最佳工藝；再以黃芪甲苷、阿魏酸含量的綜合評分為指標，通過正交實驗對當歸殘渣、黃芪和黨參的水提醇沉過程進行優化。結果:當歸提取揮發油的最佳條件為提取時間12小時，浸泡時間24小時，加水量10倍。當歸殘渣、黃芪和黨參水提醇沉過程最優提取條件為加水倍數10倍、煎煮時間20分鐘、含醇量70%。結論:該工藝穩定可行，為提高補氣生血口服液的質量穩定性和臨床用藥安全提供實驗依據。

補氣生血口服液；正交設計；黃芪甲苷；阿魏酸；揮發油得率

補氣生血口服液由黃芪、黨參、當歸等五味中藥組成，在腫瘤放療、化療的輔助治療中，取得非常好的效果。其中黃芪性平，味甘，善補氣，滋補肝腎，益精明目；黨參性平，味甘，補中益氣，健脾生津，此二味為君藥。當歸性溫，味甘、辛，補血活血，為臣藥。全方具有補氣、生血、滋補肝腎的作用，能夠緩解患者神疲乏力、頭暈眼花、四肢倦怠、腰膝酸軟等癥狀。該制劑中當歸經加水蒸餾提取芳香水；其藥渣與黨參、黃芪加水煎煮的原有工藝相比較模糊。筆者以當歸揮發油得率為指標，先優化當歸的水提醇沉條件。再以黃芪甲苷、阿魏酸含量為指標，通過正交實驗考察加水倍數、乙醇含量、煎煮時間對黃芪與黨參水提醇沉的影響，最后綜合各項指標，選出補氣生血口服液的最佳水提醇沉詳細條件，并予以驗證，為該制劑的臨床推廣提供參考，現報道如下:

1 材料

1.1 儀器 Waters 2695液相色譜儀系統(美國Waters公司提供)，ELSD檢測器(美國Waters公司提供)，電子天平(西德Sartorius公司提供)，GOA型電熱真空干燥箱(天津市東郊機械加工廠提供)，RE-98型旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠提供)，FQ-972恒溫水浴鍋(天津玻璃儀器廠提供)。

1.2 試藥 黃芪、當歸、黨參藥材均由四川新荷花中藥飲片有限公司生產，由成都食品藥品檢驗研究院彭善貴副主任中藥師鑒定。黃芪甲苷、阿魏酸對照品均購于中國藥品生物制品檢定所；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 黃芪甲苷、阿魏酸的含量測定方法

2.1.1 色譜條件 黃芪甲苷:色譜柱:phenomenex C18(250mm×4.6mm，5μm)；流動相:水∶乙腈(60∶40)；柱溫:30℃；流速:1.0 mL/min；進樣量:10 μL；ELSD檢測器；漂移管溫度:105℃；氣流速度:2.5 L/min。黃芪甲苷出現較好色譜峰，峰型良好［1］。阿魏酸:色譜柱:phenomenex C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈∶水(20∶80)，流速:1.0 mL/min，柱溫: 30℃，檢測波長:320 nm，進樣量:10 μL。在此條件下，供試品中阿魏酸較好色譜峰，峰型良好。色譜圖見圖1—2。

圖1 黃芪甲苷H PLC色譜圖

圖2 阿魏酸H PLC色譜圖

2.1.2 對照品溶液的制備 黃芪甲苷:精密稱取干燥至恒重的黃芪甲苷對照品10.0 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，即得。阿魏酸:精密稱取干燥至恒重的阿魏酸對照品81.0 mg，置150 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解至刻度，搖勻為儲備液。精密吸取1.0 mL，置25 mL棕色瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得阿魏酸含量為0.0216 mg/mL的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 黃芪甲苷:取水提醇沉液2.0 mL，加入2 mL水飽和后的正丁醇，渦旋1分鐘，3 500 r/min離心5分鐘，分取上層正丁醇液1.0 mL于另一試管中。將剩下的溶液重復提取3次，合并正丁醇液，加入5 mL氨試液，渦旋1分鐘，3 500 r/min離心5分鐘，分離棄去氨水層，重復提取3次后，正丁醇層85℃水浴氮氣吹干，加入200 μL甲醇復溶后，即得。阿魏酸:取水提醇沉液0.5 mL，精密加入1.5 mL甲醇，搖勻，稀釋液經0.45 μm微孔濾膜過濾，棄去初濾液，收集續濾液即得。

2.1.4 線性關系考察 取黃芪甲苷甲醇儲備液，加甲醇稀釋，制成濃度為5.72、3.432、1.716、0.858、0.343、0.103 μg/mL的對照品溶液。分別取10 μL進樣，測定黃芪甲苷峰面積。精密移取“2.1.2”項下的阿魏酸對照品儲備液5.0、3.0、1.5、0.5、0.2、0.1 mL置25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，得濃度為50.756、30.454、15.227、5.076、2.030、1.015 μg/mL的對照品溶液。分別取10 μL進樣，測定阿魏酸峰面積。以峰面積為橫坐標，濃度為縱坐標進行線性回歸，回歸方程與相關系數與測定范圍見表1。

表1 黃芪甲苷與阿魏酸標準曲線的回歸方程、相關系數及測定范圍

2.1.5 供試品的測定 將水提醇沉溶液按“2.1.3”項下方法分別制備黃芪甲苷與阿魏酸的供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件，以10 μL進樣，分別測定黃芪甲苷與阿魏酸的峰面積，代入相應標準曲線，乘以稀釋(或濃縮)倍數即得其水提醇沉液中黃芪甲苷與阿魏酸濃度。

2.1.6 精密度和重復性 分別將黃芪甲苷與阿魏酸對照品溶液重復測定6次，計算黃芪甲苷、阿魏酸的RSD分別為1.26%和1.51%，說明精密度良好。

2.1.7 穩定性實驗 取黃芪甲苷與阿魏酸對照品溶液與其水提醇沉提取液樣品，分別在0、1、2、6、12、24小時分別測定峰面積。照“2.1.1”色譜條件，進樣分析，分別求得在24小時內黃芪甲苷與阿魏酸對照品溶液的峰面積的RSD值分別為1.47%、2.13%，結果表明在24小時內樣品溶液該3組分的含量是穩定的。

2.1.8 加樣回收率實驗 精密量取已知含量(黃芪甲苷0.338 mg/L，阿魏酸99.96 mg/L)的同批提取液5 mL，共9份。各精密加入混合對照品溶液，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件測定，計算黃芪甲苷低、中、高質量濃度加樣回收率分別為85.92%、91.83%、89.02%，RSD分別為1.67%、2.39%、2.63%，阿魏酸低、中、高質量濃度加樣回收率為92.04%、87.68%、93.78%，RSD分別為2.70%、1.32%、3.55%。

2.2 提取工藝的優化［2］

2.2.1 當歸揮發油

2.2.1.1 因素水平設計 以當歸揮發油得率為指標，運用正交實驗對影響當歸提取主要因素:加水倍數、浸泡時間、提取時間進行考察，按正交表L9(34)進行優選，因素水平設計見表2。

表2 正交實驗因素水平

2.2.1.2 當歸揮發油得率 當歸按2010年版《中國藥典》一部附錄XD揮發油測定法甲法操作提取揮發油，藥渣再與其余藥材進行水提醇沉。

揮發油得率(%)=揮發油體積(mL)/樣品質量(g)

2.2.1.3 實驗結果及分析 按正交實驗表2各因素和水平制備的9份提取液其當歸揮發油得率結果見表3，其揮發油得率方差分析結果見表4。

表3 正交實驗結果及分析

表4 方差分析(當歸揮發油得率)

由表3結果直觀分析以及表4方差分析可知因素C(提取時間)對該提取過程的影響最大，其P值小于0.01，為重要影響因素。因素A、B(浸泡時間、加水倍數)對當歸揮發油得率的影響相當，為該提取過程的主要因素。故將煎煮條件定為C3A2B3，即用提取時間12小時，浸泡時間24小時、加水量10倍。

2.2.2 黨參與黃芪

2.2.2.1 因素水平設計 以黃芪甲苷和阿魏酸含量為指標，采用正交實驗法對影響本方藥品的主要因素含醇量、加水倍數、煎煮時間進行考察，選用按正交表L9(34)進行優選，因素水平設計見表5。

表5 正交實驗因素水平

2.2.2.2 黃芪甲苷與阿魏酸含量的測定 黃芪甲苷與阿魏酸含量按“2.1”項下方法測定。

2.2.2.3 實驗結果及分析 按正交實驗表5各因素和水平制備的9份該方口服液其黃芪甲苷與阿魏酸含量結果見表6，兩者方差分析結果見表7。

表6 正交實驗結果及分析

表7 綜合評分方差分析

由表6結果直觀分析以及表7方差分析可知，以綜合評分為指標時，A因素為主要影響因素，B、C因素為影響不明顯，其最佳組合為A2B1C2，即加水倍數10倍、煎煮時間20分鐘、含醇量70%。2.2.3 工藝驗證 按照正交實驗篩選的提取工藝條件進行5批次驗證實驗，結果顯示黃芪甲苷與阿魏酸含量的平均為0.337、110.23 μg/mL，結果表明正交實驗優選確定的工藝條件合理、穩定、可行。

3 討論

多指標的正交設計實驗分析方法有綜合平衡法和綜合評分法。綜合平衡法是對各個指標，分別進行方差分析，找出其因素水平的最優組合，再根據各指標重要性、因素主次、水平優劣等進行綜合平衡，最后確定整體最優組合。而綜合評分法是將每個實驗所得各指標實測值轉化成一個總評分，然后以此評分作為單指標來進行統計分析［3］。本實驗中，分別選取黃芪甲苷、阿魏酸作為評價指標，同時通過綜合評分法優選出最佳組合。黃芪為本方君藥，其中黃芪甲苷常作為黃芪藥材和含黃芪中成藥的指標成分，具有免疫調節，抗腫瘤作用［4-6］。因此在本實驗的綜合評分中，設定其主要活性成分黃芪甲苷所占權重系數為60%，阿魏酸為40%，從而確定A2B1C2為最佳工藝提取條件。通過驗證實驗進一步表明此工藝條件合理、穩定、可行。相關研究［7］表明:當歸的主要有效成分為當歸多糖、阿魏酸和揮發油等，這些成分具有重要的藥理活性，可促進機體免疫，抑制血小板聚集，對子宮有較強的抑制作用。本研究以當歸中主要活性成分揮發油和阿魏酸分別作為該制劑生產工藝中不同步驟的評價指標，較之以阿魏酸為單一評價指標，更有利于當歸的有效成分在制劑中保存。

［1］ 朱克旭，李永宏，劉冰冰.H PLC-ELSD法測定芪心合劑中黃芪甲苷的含量［J］.安徽醫藥，2011，15(11):1364-1365.

［2］ 張丕德，龍曉英.正交設計與數據分析在藥學研究中的應用［J］.廣東藥學院學報，2009，25(5):546-551.

［3］ 張麗，姜華，郭敏.中風顆粒處方藥材的醇提工藝研究［J］.西部中醫藥，2015，28(4): 36-38.

［4］ 凌峰，薛博瑜，柳璋璞，等.黃芪、苦參、知母配伍方體外抗腫瘤細胞作用研究［J］.長春中醫藥大學學報，2014，30(6):400-402.

［5］ 杜娟，陳敏珠.黃芪總提物抗腫瘤作用及其機制研究［J］.中華中醫藥雜志，2006，21(12): 771-772.

［6］ 王儉，胡溪恬，劉巧.黃芪注射液影響人惡性黑色素瘤細胞凋亡的實驗研究［J］.吉林中醫藥，2015，35(4):407-414.

［7］ M aRJ，W angQ，ChenX L，etal.Research and devel opm ent of A ngel i ca si nensi s (O l i v.)D i el s［J］.Chi n Tradi t H erb M ed，2002，33(3):280-288.

Multi-index Optimization Method on the Process of Extraction and Purification for BuQi ShengXue Oral Liquid

CHEN Lu,LI Jinqi,BIAN Yuan,HU Yuan
Medical Academy in Sichuan.Sichuan Provinical People′s Hospital,Chengdu 610072,China

Objective：Using multi-index to control,and using orthogonal design for the process of extraction and purification for BuQi ShengXue oral liquid.Methods：Essential oil from DangGui(angelica sinensis)was taken as index,orthogonal design was adopted to select the optimal process for aromatic water extracted from DangGui;then, composite score of astraloside and fumalic acid as index,the process of extraction and purification for the residue of DangGui,HuangQi(astragalus)and DangShen(codonopsis)were optimized by orthogonal design.Results：The best condition of essential oil extracted from DangGui was extracting time 12 hours,soak time 24 hours,add-water quantity ten times.The best extraction condition of the process of extraction and purification for DangGui residue, HuangQi and DangShen were add-water quantity ten times,decoction time 20 minutes and the level of alcohol 70%. Conclusion：This process was steady and feasible,it provides experimental basis for improving the stable quality of BuQi ShengXue oral liquid and clinical medication safety.

BuQi ShengXue oral liquid;orthogonal design;astraloside;fumalic acid;essential oil ratio

R284.2

A

1004-6852(2016)10-0040-04

2016-03-27

四川省中醫藥管理局青年中醫藥課題(編號2010-64);四川省醫學科學院·四川省人民醫院2014年苗圃計劃項目。

陳璐(1975—)，女，副主任藥師。研究方向:中藥制劑質量分析及治療藥物監測。