RP-HPLC法測定苦豆子總堿中苦參堿與氧化苦參堿、槐果堿與氧化槐果堿含量*

陳海燕，冷曉紅，郭鴻雁，李 軍，郝彩琴

寧夏職業技術學院，寧夏 銀川 750021

RP-HPLC法測定苦豆子總堿中苦參堿與氧化苦參堿、槐果堿與氧化槐果堿含量*

陳海燕，冷曉紅，郭鴻雁，李 軍，郝彩琴

寧夏職業技術學院，寧夏 銀川 750021

目的:建立測定苦豆子總堿中氧化型生物堿與還原型生物堿含量的反相高效液相色譜法。 方法:采用C18鍵合硅膠反相柱，以乙腈-0.05 m ol/L磷酸二氫鉀水溶液(三乙胺2.0 m L/L)為流動相，梯度洗脫，檢測波長205 nm，柱溫30℃，流速1.0 m L/m i n。結果:氧化苦參堿、氧化槐果堿、苦參堿、槐果堿分離良好，氧化苦參堿平均回收率為99.10%，RSD為1.15%；苦參堿平均回收率為98.76%，RSD為1.64%；氧化槐果堿平均回收率為100.12%，RSD為1.86%；槐果堿平均回收率為98.35%，RSD為2.01%。結論:所建立的測定苦豆子總堿中氧化型與還原型生物堿含量方法專屬性強，靈敏度高，能有效控制苦豆子總堿質量。

反相高效液相色譜法；苦豆子總堿；氧化苦參堿；氧化槐果堿；苦參堿；槐果堿；含量測定

苦豆子Sophora aLopecuroides L.為豆科槐屬多年生草本植物，生物體內含有20多種生物堿類成分［1］，藥用部位主要為干燥地上部分及種子，性寒有毒、味極苦?？喽棺涌倝A(Total alkali Sophora alopecuroids L.，TASa)是從苦豆子的干燥全草和種子中提取的總生物堿，主要含有槐胺堿、槐定堿、氧化苦參堿、氧化槐果堿、苦參堿、槐果堿等?，F代醫學研究表明，苦豆子總堿具有抗腫瘤、抗菌、抗炎以及清熱解毒、祛風燥濕作用［2-5］。以苦豆子總生物堿為原料生產的克瀉靈片是治療急、慢性腸炎、結腸炎的理想藥品，為國家中藥保護品種。此外在治療婦科炎癥、慢性乙型病毒性肝炎等方面苦豆子總堿也具有明顯療效。

苦豆子總堿原質量標準采用HPLC測定槐果堿的含量，僅僅測定單一成分槐果堿的含量難以反映苦豆子總堿中生物堿的實際含量狀況，因此本實驗采用HPLC法測定氧化苦參堿與苦參堿、氧化槐果堿與槐果堿含量，為制定苦豆子總堿質量標準提供參考依據。

1 材料

1.1 儀器 Agilent LC-1220高效液相色譜儀，二極管陣列檢測器，自動進樣器；Mettler Toledo萬分之一電子天平(上海儀器有限公司提供)。

1.2 試藥 氧化苦參堿對照品(批號:110780-201007)，氧化槐果堿(批號:111652-200301)，苦參堿對照品(批號:110805-200508)均購自于中國藥品生物制品檢定所；槐果堿購于寧夏紫荊花藥業有限公司，純度≥98.0%。苦豆子總堿由寧夏中藥材開發與利用工程技術研究中心提供，為褐色的稠膏物；乙腈、甲醇為色譜純，磷酸二氫鉀、濃氨水為分析純，超純水實驗室自制。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱Agilent TC-C18(2)(250 mm× 4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈與0.05 mol/L磷酸二氫鉀水溶液(加三乙胺2.0 mL/L)；采用梯度洗脫，0～12 min～45 min，乙腈與磷酸二氫鉀比例為6∶94～10∶90～10∶90；檢測波長:205nm；流速:1.0mL/min；進樣量10 μL，柱溫30℃，理論塔板數以氧化苦參堿峰計不得低于10 000。

2.2 對照品溶液的制備 取氧化苦參堿對照品、氧化槐果堿對照品、苦參堿對照品和槐果堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含氧化苦參堿、氧化槐果堿約為0.16 mg，苦參堿、槐果堿約為0.12 mg的混合溶液，過0.45μm有機微孔濾膜，按“2.1”項色譜條件進樣，記錄色譜圖。見圖1。

注:1氧化苦參堿；2氧化槐果堿；3苦參堿；4槐果堿。圖1 4種生物堿對照品色譜圖

2.3 供試品溶液的制備 取苦豆子總堿約0.3g，精密稱定，加甲醇溶解定容至100 mL量瓶中，混勻，過0.45 μm有機微孔濾膜，得供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進樣，記錄色譜圖。見圖2。在本色譜條件下，氧化苦參堿、氧化槐果堿、苦參堿、槐果堿分離良好，分離度均大于1.5。按供試品溶液制備方法得陰性對照溶液，色譜實驗結果表明無溶劑干擾，見圖3。

圖3 陰性對照色譜圖

2.4 線性關系考察 分別精密稱定氧化苦參堿、氧化槐果堿、苦參堿、槐果堿對照品適量，加甲醇制成每1mL含氧化苦參堿0.4448mg、氧化槐果堿0.491 7 mg、苦參堿0.421 6 mg、槐果堿0.426 4 mg的混合溶液，精密量取混合對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.5、5.0、8.0 mL至10 mL的量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件進行分析。以對照品溶液質量濃度為橫坐標(X)，峰面積值為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，得氧化苦參堿、氧化槐果堿、苦參堿、槐果堿的線性回歸方程分別為:

線性范圍分別為:22.24～355.8，24.58～393.4，21.08～337.3，21.32～341.1 mg/L，結果表明4種生物堿線性關系良好。

2.5 精密度實驗 按“2.1”項色譜條件下，取混合對照品溶液10 μL，重復進樣6次，以峰面積進行計算，結果氧化苦參堿、氧化槐果堿、苦參堿、槐果堿峰面積的RSD分別為1.00%、1.56%、0.68%、0.66%。

2.6 穩定性實驗 取同一苦豆子總堿樣品溶液，分別于0、3、6、9、12、15、18、21、24小時進樣10 μL檢測色譜峰峰面積。結果氧化苦參堿、氧化槐果堿、苦參堿、槐果堿峰面積的RSD分別為1.38%、1.75%、0.68%、3.89%。表明樣品溶液在24小時內穩定性良好。

2.7 重復性實驗 取同一批號苦豆子總堿供試品，精密稱取6份，按“2.3”項下的方法制備供試品溶液，測定各生物堿含量，結果氧化苦參堿、氧化槐果堿、苦參堿、槐果堿的RSD分別為0.38%，1.51%、1.21%、1.18%。

2.8 加樣回收率實驗 取同一批號已知含量的苦豆子總堿供試品6份，每份約0.15g，精密稱定，將甲醇溶解后轉移至100 mL量瓶中，每份樣品分別精密加入氧化苦參堿、氧化槐果堿、苦參堿、槐果堿對照品，量與供試品中所含成分比例約為1∶1，用甲醇定容至刻度，混勻，即得加樣回收率供試品溶液，按上述色譜條件測定，計算回收率。結果氧化苦參堿、氧化槐果堿、苦參堿與槐果堿的平均回收率分別為99.10%，100.12%、98.76%、98.35%；RSD分別為1.15%、1.86%、1.64%、2.01%。

2.9 樣品含量測定 精密稱取3批次苦豆子總堿樣品，依法制備供試品溶液進樣檢測，按外標法計算生物堿百分含量，結果見表1。

表1 苦豆子總堿含量(以干燥品計算) %

3 討論

3.1 檢測波長 氧化苦參堿、氧化槐果堿、苦參堿和槐果堿在205 nm處有較大吸收，色譜峰對稱性良好，故選205 nm作為檢測波長。

3.2 流動相梯度洗脫 以乙腈-0.05 mol/mL磷酸二氫鉀溶液(2.0 mL/L三乙胺)為流動相，考察不同梯度洗脫，1)0min→10 min→12min→45min，乙腈:磷酸二氫鉀為5∶95→8∶92→10∶90→10∶90；2)0min→13min→45min，乙腈∶磷酸二氫鉀為6∶94→10∶90→10∶90；3)0 min→12 min→45 min，乙腈∶磷酸二氫鉀為6∶94→10∶90→10∶90。結果“3)”的洗脫效果最好，4種生物堿與鄰近峰的分離度大于1.5。

苦參堿、氧化苦參堿、氧化槐果堿、槐果堿等是苦豆子植物的主要成分，并且氧化苦參堿、氧化槐果堿的含量高于苦參堿和槐果堿的含量［6-7］，表明在植物體內氧化苦參堿、氧化槐果堿應為較穩定的天然存在形式，且提取過程中苦參堿與氧化苦參堿、槐果堿與氧化槐果堿存在著相互轉化［8-11］，因此測定苦豆子總堿含量時，不能忽略苦豆子提取過程中氧化型生物堿與還原型生物堿相互轉化的影響［12-13］，所以本實驗采用HPLC法同時測定氧化苦參堿和苦參堿、氧化槐果堿和槐果堿的含量，以便很好地控制苦豆子總堿質量。

［1］ 秦學功，元英進.苦豆子種子中生物堿的冷浸提取實驗研究［J］.中草藥，2001，32(7):604-605.

［2］ 焦河玲，鄧虹珠，王曉娟，等.苦豆子總堿對S180荷瘤小鼠的抑制作用［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17(2):163-165.

［3］ 周婭，楊志偉，趙建寧，等.苦豆子總堿的體外抗菌活性研究［J］.2000，22(2):79-81.

［4］ 周毅，鄧虹珠，鄧子華，等.苦豆子總堿對大鼠實驗性結腸炎CD 4+CD 25+，CD 8+CD 28-表達的影響［J］.中國臨床康復，2006，10(47):89-91.

［5］ 邢世瑞.寧夏中藥志上卷［M］.2版.銀川:寧夏人民出版社，2006:130.

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RP-HPLC Determination of the Contents of Matrine,Oxymatrine,Sophocarpine and Oxysophocarpine in Total Alkaloid of Sophora Alopecuraidesl

CHEN Haiyan,LENG Xiaohong,GUO Hongyan,LI Jun,HAO Caiqin
Ningxia polytechnic,Yinchuan 750021,China

Objective：To establish a RP-HPLC method for dertermination of the contents of oxyalkaloid and reduced alkaloid in total alkaloid of sophora alopecuraidesl.Methods：RP-C18bonded silica gel column was adopted, acetiontrile-0.05 mol/L potassium Bi-phosphate solution(triethylamine 2.0 mL/L was mobile phase,and gradient elution,the detection wavelength was 205nm,column temperature was 30 degrees celsius,the flow rate was 1.0mL/min.Results：Average recovery rate of matrine,oxymatrine,sophocarpine and oxysophocarpine were 99.10%,RSD was 1.15%,matrine was 98.76%;RSD was 1.64%,oxysophocarpine was 100.12%,RSD was 1.86%; sophocarpine was 98.35%,RSD was 2.01%.Conclusion：The method for dertermination of the contents of oxyalkaloid and reduced alkaloid in alkaloid of sophora alopecuraidesl is specific and highly sensitive,which can control the quality of total alkaloid of sophora alopecuraidesl effectively.

RP-HPLC;total alkaloid of sophora alopecuraidesl;oxymatrine;oxysophocarpine;matrine; sophocarpine;dertermination of contents

R284.1

A

1004-6852(2016)10-0033-03

2016-02-27

國家科技支撐計劃(編號2011BA I05B00)。

陳海燕(1966—)，女，教授。研究方向:藥物分析檢驗。