膝骨性關節炎患者低密度脂蛋白受體相關蛋白5基因與中醫體質相關性研究*

周明旺，李盛華，陳 嫻，王 金，陳 威

甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050

膝骨性關節炎患者低密度脂蛋白受體相關蛋白5基因與中醫體質相關性研究*

周明旺，李盛華，陳 嫻，王 金，陳 威

甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050

目的:研究膝骨性關節炎(K O A)患者低密度脂蛋白受體相關蛋白5基因rs3736228位點多態性與中醫體質的相關性。方法:對K O A患者進行中醫體質問卷調查，對平和質、陽虛質、陰虛質3種高發體質的K O A患者進行LRP5基因多態性檢測，同時隨機選取54例健康非血緣關系志愿者作為對照組。結果:本次研究共檢測出LRP5基因rs3736228位點三種基因型，分別為CC、TT、CT。病例組與對照組比較，各基因型及等位基因差異無統計學意義（P＞0.05）。平和質病例組、陽虛質病例組、陰虛質病例組分別與對照組比較，各基因型與等位基因差異無統計學意義（P＞0.05）。結論:LRP5基因rs3736228位點多態性可能與K O A無相關性。

骨性關節炎，膝；中醫體質；LRP5；基因多態性

低密度脂蛋白受體相關蛋白5(low density lipoprotein receptor-related protein 5，LRP5)屬于低密度脂蛋白受體家族，是Wnt/β-catenin信號通路中極其重要的信號蛋白［1］。相關研究顯示，LRP5通過影響軟骨細胞中Ⅱ型膠原、MMP-3、MMP-13的水平，在Wnt/β-catenin信號通路介導的骨性關節炎軟骨退變中發揮至關重要的作用［2-3］。近年來，中醫體質學揭示疾病病因病機的獨特優勢逐漸受到重視，相關流行病學調查顯示中醫體質與膝骨性關節炎(knee osteoarthritis，KOA)的發病關系密切。本研究通過探討KOA患者LRP5基因rs3736228位點多態性與其中醫體質的關系，嘗試闡明KOA患者高發體質發病的內在生物學基礎，為辨識體質防治KOA提供科學依據。現報道如下:

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2014年2月至2015年6月在甘肅省中醫院關節骨科、骨傷病科門診和住院部的KOA患者進行問卷調查，將調查病例所得數據資料錄入Excel表格建立數據庫。從數據庫中篩選出陽虛質KOA患者37例、陰虛質KOA患者20例、平和質KOA患者39例為病例組。隨機選取健康非血緣關系志愿者54例作為對照組。

1.2 納入標準 納入:1)受試者簽訂知情同意書；2)研究方法經醫院倫理委員會討論并獲得批準。

1.3 排除標準 排除:1)診斷為創傷性KOA的患者；2)妊娠或哺乳期婦女，過敏體質者或不能接受本調查者；3)類風濕性關節炎、強直性脊柱炎及患有嚴重膝關節疾病者；4)合并有嚴重的內臟病變者或其他嚴重代謝異常疾病及骨腫瘤患者；5)精神病患者、智力障礙者；6)正在參加其他臨床試驗的患者。

1.4 方法

1.4.1 血液D N A提取 使用北京百泰克生物技術有限公司生產的中量全血基因組DNA提取試劑盒(溶液型)自全血中提取DNA，提取過程中可見白色的DNA絮狀物，加入DNA溶解液水化后存放在2～8℃冰箱保存，長時間存放，可放置在-20℃冰箱。

1.4.2 PCR擴增 選擇LRP5基因的SNP位點為rs3736228，從文獻［4］中得到該位點的上下游引物堿基序列，將該序列進行驗證后委托上海生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。擴增引物序列:上游:5′-GCT GGG CTG TTG ATG TTT AGA-3′；下游:5′-AGA GGC AAG GTT TTC CCA TAA-3′。PCR反應體積共25μL，其中2×EsTaqMasterMix12.5μL，上游引物(ρ=10 μM)1μL，下游引物(ρ=10 μM) 1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。將上述體系加入0.5 mL EP管后瞬時離心，防止液體附壁，再放入PCR儀擴增得到產物。PCR反應條件:94℃預變性2分鐘；循環參數:94℃變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，35個循環；最后延伸:72℃，2分鐘，保存溫度4℃。

1.4.3 凝膠電泳 將PCR擴增產物5 μL及DNA Marker 6 μL進行凝膠電泳，電泳電壓120 V，電泳20分鐘，待條帶移動到距凝膠前沿約2 cm時，停止電泳。將電泳后的膠板放入凝膠成像儀中進行觀察和拍照。

1.4.4 PCR產物測序分析 凝膠電泳后運用凝膠成像儀觀察產物，挑選出成像明顯的PCR產物進行測序分析，測序工作委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.5 統計學方法 采用Excel建立數據庫，SPSS 19.0軟件統計分析。通過χ2檢驗分析病例組與對照組及病例組間各基因型與等位基因分布差異，以P＜0.05認為具有統計學差異。若χ2檢驗分析有意義則進一步進行logitic分析，尋找有顯著差異的基因型和等位基因，以P＜0.05認為具有統計學差異。

2 結果

2.1 PCR擴增結果 PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠液電泳后，在相應位置有清晰的DNA條帶，長度與DNA Marker指示位置一致，表明為LRP5基因位點相應序列的PCR擴增結果。結果見圖1。

圖1 PCR擴增產物跑膠結果

2.2 基因測序結果

2.2.1 LRP5基因rs3736228位點測序結果 PCR擴增產物的基因測序結果經chromas、BioEdit軟件分析后，LRP5基因位點共檢測出CC、TT、CT 3種基因型，見圖2。

圖2 LRP5基因rs3736228位點測序結果

2.2.2 K O A患者中醫體質與LRP5基因rs3736228位點多態性的關系 LRP5基因rs3736228位點多態性病例組與對照組比較，總體上各基因型等位基因分布無明顯差異(χ2=0.56，P＞0.05；χ2=0.067，P＞0.05)。見表1。

表1 LRP5基因rs3736228位點病例組與對照組基因型、等位基因分布

LRP5基因rs3736228位點，陽虛質病例組與對照組比較，總體上各基因型無統計學意義(χ2=0.209，P＞0.05)，等位基因分布差異無統計學意義(χ2=0.129，P＞0.05)；陰虛質病例組與對照組比較，總體上各基因型及等位基因分布差異無統計學意義(χ2=0.355，P＞0.05；χ2=0.169，P＞0.05)；平和質病例組與對照組比較，總體上各基因型及等位基因分布差異無統計學意義(χ2=2.288，P＞0.05；χ2=0.511，P＞0.05)。見表2。

表2 陽虛質、陰虛質、平和質病例組與對照組LRP5基因rs3736228位點基因型、等位基因分布

3 討論

本研究通過基因測序分析LRP5基因rs3736228位點與KOA高發體質陽虛質、陰虛質、平和質之間的關系，結果顯示KOA患者中LRP5基因rs3736228位點共檢測出3種基因型，分別為CC型、TT型、CT型。3種基因型及等位基因分布頻率在病例組與對照組中差異無統計學意義。進一步將陽虛質、陰虛質、平和質病例組與對照組進行兩兩比較，各基因型及等位基因分布也無統計學差異。提示LRP5基因rs3736228位點多態性可能與KOA的發病無關。

LRP5蛋白是一種跨膜受體蛋白，其基因位于染色體11q-13上，由1615個氨基酸組成，包含23個外顯子。該基因rs3736228多態性位點位于編碼LDL受體結構域的18號外顯子［3］。以往研究顯示，該位點的突變與骨質疏松、骨折、糖尿病等有關，但與KOA相關性的研究較少。國外學者［4］曾對鹿特丹及英國青福德OA患者該位點的多態性進行檢測，發現該位點多態性與髖、膝、手指間關節的OA影像學K/L分級及患者血清CTX-Ⅱ水平無相關性。本次研究結果也顯示LRP5基因rs3736228位點多態性與KOA無明顯關聯。由于納入標準不同以及研究對象的異質性，雖然兩次研究均為陰性結果，尚不能認為該位點與KOA無關。此外，多個文獻支持LRP5蛋白通過Wnt/β-catenin信號通路在KOA發病、發展過程中的重要作用［5］，我們不能排除由該基因突變導致KOA可能不止rs3736228一個位點，盡管該位點的突變被認為是調控Wnt信號通路重要原因。

本研究的不足之處在于:首先研究的病例數較少；其次病例組患者存在多種混雜因素，如KOA病情嚴重程度、性別、年齡、伴發其他一些疾病；再次選擇單個基因的單個位點進行研究。以上這些情況都可能對最后的結果造成偏倚，因此上述結果尚需要在多地區進行設計嚴謹、大樣本、多個位點多態性的研究予以驗證，從而闡明LRP5基因多態性影響KOA的機制，為KOA的辨識體質防治提供更科學的診療指標，為臨床個體化藥物治療和預防KOA提供幫助。

［1］ 喬斌，李盛華，周明旺，等.W nt/β-cat eni n信號通路與軟骨代謝相關性研究進展［J］.中國中醫骨傷科雜志，2014，22(10)：75-77.

［2］ Shi n Y，H uh Y H，K i m K，etal.Low-densi t y l i poprot ei n recept or-rel at ed prot ei n 5 governsW ntm edi at ed ost eoart hri t i c cart i l age dest ruct i on［J］.A rt hri t i s Res Ther，2014，16(1):37-42.

［3］ 尤海菲.LRP5基因多態性、環境因素及其交互作用與2型糖尿病的關聯研究［D］.鄭州：鄭州大學，2014：38-48.

［4］ K erkhofJM，U i t t erl i nden A G，V al des A M，etal.Radi ographi c ost eoart hri t i s at t hree j oi nt si t es and FRZB，LRP5，and LRP6 pol ym orphi sm s i n t w o popul at i on-based cohort s［J］.O st eoart hri t i s Cart i l age，2008，16(10)：1141-1149.

［5］ Papat hanasi ou I，M al i zos K N，Tsezou A.Bone m orpho genet i c prot ei n-2-i nduced W nt/β-cat eni n si gnal i ng pat hw ay act i vat i on t hrough enhanced l ow-densi t yl i poprot ei n recept or-rel at ed prot ei n 5 cat abol i c act i vi t y cont ri but es t o hypert rophy i n ost eoart hri t i c chondrocyt es［J］.A rt hri t i s Res Ther，2012，18，14(2)：82-89.

Relevant Study on Low-density Lipoprotein Receptor-related Protein 5 Gene and TCM Constitutions of the Patients with Knee Osteoarthritis

ZHOU Mingwang,LI Shenghua,CHEN Xian,WANG Jin,CHEN Wei
Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730050,China

Objective：To study the relationship between low-density lipoprotein receptor-related protein 5 (LRP5)Gene：site polymorphism of rs3736228 and TCM constitution of the patients with knee osteoarthritis(KOA). Methods：Questionnaire survey of TCM constitution was conducted in patients with KOA,LRP5 gene polymorphism was detected in KOA patients of specific,Yang-deficiency and Yin-deficiency constitutions,and 54 healthy non-genetic connection volunteers were selected randomly as the control group.Results：Three genetic types of rs3736228 site of LRP5 gene were detected in this study,and they were CC,TT and CT.patients group compared withthecontrolgroup,therewerenostatisticaldifferencesinthecomparisonofallkindsgenotypesandalleles(P＞0.05). Specific cases group,Yang-deficiency cases group and Yin-deficiency cases group compared with the control group separately,there were no statistical differences in all kinds of genotypes and alleles(P＞0.05).Conclusion：There might be no correlation between rs3736228 site morphism of LRP5 gene and KOA.

osteoarthritis,knee;TCM constitution;LRP5;gene polymorphism

R684.3

A

1004-6852(2016)10-0005-03

2016-05-27

甘肅省自然科學基金項目(編號1208RJZA 041)。

周明旺(1977—)，男，博士學位，副主任醫師。研究方向:中醫藥防治骨與關節疾病。